荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR实验使用方法
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
荧光定量PCR操作流程
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
abi quantstudio 荧光定量pcr仪操作规程
abi quantstudio 荧光定量pcr仪操作规程以下是abi quantstudio 荧光定量pcr仪的操作规程：1. 打开仪器：确保电源线插入到电源插座中，按下电源开关，荧光定量PCR仪开始启动。
启动完成后，屏幕会显示主界面。
2. 准备样品：将待测样品按照实验方案进行处理和准备，包括提取和纯化核酸、制备反应体系等，确保样品标签的正确性。
3. 设置反应模板：在主界面上选择“新建实验”的选项，并选择荧光定量PCR反应模板。
根据实验需求设置反应模板，包括样品的位置、引物和探针的浓度和体积等。
4. 加载样品：根据设置的标本位置，使用注射器或微量移液器将样品逐一加载到相应的孔中。
确保每个孔都正确对应到相应的标本。
5. 设置PCR反应参数：通过点击“设置反应参数”按钮，进入PCR反应参数设置界面。
根据实验需求设置温度、时间和周期等参数。
设置完成后，保存反应参数。
6. 开始PCR反应：点击“开始实验”按钮，启动PCR反应。
仪器会自动根据设置的参数进行PCR反应。
在PCR反应过程中，可实时监测反应的进展和荧光信号的变化。
7. 数据分析：PCR反应结束后，仪器会自动停止反应。
通过点击“数据分析”按钮，可查看PCR反应结果，包括荧光信号曲线、阈值循环数和浓度等数据。
可以保存数据文件或导出结果。
8. 关机：实验结束后，点击主界面上的“关机”选项，按照仪器提示进行关机操作。
拔下电源线，清理实验平台和反应模板，保持仪器的整洁。
以上是abi quantstudio 荧光定量pcr仪的操作规程，一定要按照实验方案和操作规程进行实验，以保证实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
qpcr的操作流程
qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
下面将介绍qPCR的操作流程。
1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。
确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。
2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。
确保核酸的质量符合实验要求。
3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。
4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。
包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。
确保反应体系的配比准确。
5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。
根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。
6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。
确保数据的准确性和可靠性。
7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。
判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。
总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。
通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。
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细胞RNA提取
5. 洗涤：
将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μl• RNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。• 注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。 • 2）若提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。 • 3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。•
人cDNA RNase-Free Water
0 μl 57.6 μl
2 μl 7.2 μl
3. 将配制的预混体系，分装到八连管中。共加6个孔，每个孔中加 入18 μl的预混体系。
荧光定量PCR
4. 模板加入：
每个孔中分别加入2 μl模板，加样顺序如下：
加样孔 样品 1 原液 2 稀释10倍 3 稀释100 倍 4 稀释1000 倍 5 稀释10000 倍 0 水
6. RNA检测：
用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；
测定样品纯度和浓度。
纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 <1.8 蛋白质或酚类污染 >2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数
逆转录
实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤：
荧光定量PCR
北京康为世纪生物科技有限公司
细胞RNA提取
样品：293T细胞 试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇 方法：柱式
原理：
• • 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个 体系中的中间相和水相，从而得以分离。
Thank You !
加入体 积
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 6. PCR反应程序：
步骤 预变性 变性 退火/延伸 融解曲线分 析 温度 95℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 时间 10min 15s 1 min 15s 1 min 15s 15s 注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分 装到八连管中。 2. 稀释模板时，需要混匀。 不要直接在八连管管壁或管盖上做标
原液 5 μl （从1号管取） 5 μl（从2号管取） 5 μl（从3号管取） 5 μl（从4号管取）
6
45ul
对照
荧光定量PCR
2. 配制PCR预混反应体系：
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
试剂 2×UltraSYBR Mixture Forward Primer，10 µ M Reverse Primer，10 µ M 配制的8个孔的预混 体系 80 μl 6.4 μl 20 μl反应体系 10 μl 0.8 μl
材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物
实验步骤：
1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。
编号
1 2 3 4 5
模板稀释 倍数
1倍 10倍 100倍 1000倍 10000倍
水用量
0ul 45 μl 45 μl 45μl 45 μl
模板用量
细胞RNA提取
3. 过柱子：
吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱 （Spin• Column RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
1. 将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和
RNase- Free Water溶解并置于冰上备用。
2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
试剂 dNTP Mix，2.5 mM Each Primer Mix RNA Template 5×RT Buffer DTT，0.1 M HiFi-MMLV，200 U/μl RNase-Free Water 20 μl 反应体系 4 μl 2 μl 2 μl 4 μl 2 μl 1 μl 5 μl
4. 洗涤：
向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500μl• Buffer• RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
冰上配制 短暂离心
42℃ 50min 70℃ 15min
逆转录
3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4. 42℃孵育3Байду номын сангаас~50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于
冰上冷却。 5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20℃长期保存。
荧光定量PCR
细胞RNA提取
1. 裂解： 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解； 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离 2. 抽提： Ø 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min； Ø4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， RNA在上层水相中