CRISPRCas9基因敲除原理及其应用培训课件
crispr-cas基因编辑技术原理与应用PPT精选文档
31
进展
2 在斑马鱼研究方面，通过注射两个 简单的体外合成的组件(即使用一个密 码子优化的Cas9 和单链向导 sgＲNA) 到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。 这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼 基因功能和基因相互作用提供了一个 有效的方式。
32
进展
3 干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模 型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个报告基因整合成一 种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后 要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA 和crＲNA 分开单独表达， 还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一 步修改 sgＲNA 的设计方案，让它与双 ＲNA 复合体的结构更加 相近，就能够进一步提高 Cas9 系统的基因组编辑效率。
缺陷
成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。
16
基因编辑功能应用
CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种 的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模 型。
如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者 报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病 的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。
33
进展
4 在拟南芥研究方面，利用C ＲISPＲ/Cas 系统对分裂组织有 针对性地定点诱变产生遗传突变， 结果表明，在拟南芥中使用 CＲ ISPＲ/Cas系统为 RNA 引导的核 酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组 织提供了一种有效的遗传基因工 程的方法。
34
进展
5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 较 高，最
缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是
最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用及发展.39页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
最详细：CRISPR-Cas9系统原理应用 及发展.
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
crispr原理解析ppt课件
研究报告微课研究报告随着互联网技术的迅猛发展和教育改革的推进，微课在教育领域逐渐被广泛应用。
本研究准备从微课的定义、特点、优势以及影响因素等方面进行探讨，以期能够全面地了解微课的现状和未来发展趋势。
一、微课的定义微课是一种基于互联网技术的教学模式，通过小型化的课程内容和精确的讲解来实现个性化学习。
微课的特点是时间短、内容精确、形式多样、互动性强。
二、微课的特点1. 时间短：微课通常时间控制在5-15分钟之内，符合学生的注意力持久时间，有利于提高学习效果。
2. 内容精确：微课的内容经过精心筛选和设计，主要针对某一特定知识点进行解释和讲解，能够达到针对性学习的效果。
3. 形式多样：微课可以采用视频、动画、图文等多种形式进行呈现，满足不同学生的学习需求。
4. 互动性强：微课通过强调学生参与和互动，鼓励学生提问和讨论，促进知识的交流与共享。
三、微课的优势1. 个性化学习：学生可以根据自身的学习需求，在自己方便的时间和地点进行学习，实现个性化学习。
2. 时间灵活：微课的时间可以根据学生的学习进度进行调整，不受固定的上课时间限制。
3. 提高效果：微课的精准讲解和多样化的表达方式有助于提高学生的学习效果。
4. 促进互动：微课通过提供学习平台，鼓励学生之间的讨论和互动，促进知识的交流与共享。
5. 教师支持：微课方式可以为教师提供更多的教学资源和支持，提高教学质量。
四、微课的影响因素微课的应用受到多方面的影响，主要包括教育政策支持、师生态度、技术设备和教育资源等因素。
教育政策的支持和推广是微课发展的保障，师生对微课的态度和接受程度也直接影响着微课的应用情况。
此外，技术设备和教育资源的提供与实施也需要充分考虑。
综上所述，微课作为一种新兴的教学模式，具有许多独特的优势和特点。
因此，在教育领域中，推广和应用微课具有重要意义。
然而，在微课的发展过程中，还需关注教育政策的支持、师生态度、技术设备和教育资源等方面的问题，进一步提升微课的应用效果。
crisprcas基因编辑技术原理与应用ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞 操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展 前景
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
What
01
Clustered regularly interspaced
shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物 模型、改良动物品系和研制动物反应器等。
基因编辑技术在医学研究中的应用培训课件
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领 域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将 加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究 的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和 修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确 保基因疗法药物的安全性和有效性得到科 学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进 行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平 上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创 新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞 、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造 ，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得 足够数量的治疗用细胞。
CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介ppt课件
CRISPR基因座的表达（包括转录 和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的crRNA 前体，然后逐步加工成小的成 熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后，
形成NA-Cas蛋白复合体，
精选版课件ppt
5
2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
沈彬，2015
精选版课件ppt
18
6.降低脱靶效应
添加同源臂(homology arm,HR)
Yu Hisano et al.2014
精选版课件ppt
19
6.降低脱靶效应
FoKI-dCas9
Nicolas Wyvekens et al.2015
精选版课件ppt
20
6.降低脱靶效应
CRISPR/Cpf1系统
精选版课件ppt
11
4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
精选版课件ppt
12
4.CRISPR/Cas9系统
精选版课件ppt
13
4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
细胞生物学CRISPR-CAS9 ppt课件
加拿大盖尔德纳奖
►诺奖风向标：在过去收到这个奖项的320位科学家中，有83位紧接着获得诺奖 ►今年获得该奖项的5位科学家全都来自一个领域：CRISPR-Cas9基因组定点编 辑技术。
加拿大盖尔德纳奖
►获奖理由：开发CRISPR-CAS用于真核细胞的基因编辑
Jennifer Doudna 、张锋、Emmanuelle Charpentier
专利之争
►2013年发表在《科学》杂志上的论文，成为CRISPR-Cas9真核细胞基因 编辑领域发表最早、被引用数量最多的论文之一。 ►张锋通过向专利局证明自己的实验记录而第一个得到相关专利。
专利之争
►“面对这项技术，不会有人轻易退出。站在双方背后的，除了各自的研
究所和大学，更有着数十亿的商业投资和运作。这场仍未有定式的专利纠 纷注定会成为一场旷日持久的争论，也许是一两年，也许更久。”
“ZFN提供了基因组编 辑技术的理论基础，但 TALEN做了ZFN的大部 分工作，且更便宜、更 快、更好。”
基因组编辑上的新生力量， 论文数量在5年间增长了5 倍。
CRISPR/Cas系统元件和特征
►CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列
►CRISPR/Cas系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成
►sg-RNA：single guide RNA
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
CRISPR-Cas9 as a Genome Engineering Tool.
Biology of the type II-A CRISPR-Cas system
CRISPR-Cas9系统原理应用及发展ppt课件
1
1 CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列。
8
2 CRISPR-Cas系统的发现
9
2 CRISPR-Cas系统的发现
10
2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免 疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌 进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是 由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔 序列（spacer）来实现的。
15
3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
5
1.1 CRISPR结构
6
1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在
guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
pGK1.1
设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA
将双链DNA连接到载体中
转化G10competentcell筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞在细胞内crRNA识别靶位点，Cas9对靶位点进行随机剪切
CruiserTM酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。
病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPRv2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。
同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
（汉恒生物提供CRISPR/cas9腺病毒包装）。