酶解制备褐藻胶寡糖及其产物的抗氧化活性分析
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【摘要】为探索假交替单胞菌（ Pseudomonas syringae）重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的动态过程变化，采用DNS法和苯酚－硫酸法分别测定体系还原糖和总糖，根据二者比例，得出酶解产物随时间变化的平均聚合度，从而研究各因素对褐藻胶降解过程的影响，确定褐藻胶酶解工艺条件。
结果表明，重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的适宜工艺条件为：水解温度25℃， pH 7�5，初始底物质量浓度7 g ／L，加酶量0�48 U，静置条件下酶解反应210 min。
在此工艺条件下，产生的还原糖的质量浓度达0�878 g／L，平均聚合度为3。
酶解终产物的质谱鉴定结果显示为单糖、二糖和四糖。
%The aim of the study is to determine the dynamic process and technical conditions of alginate degradation by the recombinant alginate lyase from Pseudomonas syringae. The contents of the reducing sugar and the total polysaccharide were determined by 3 , 5-dinitrosalicylic acid assay and phenol-sulfuric acid method, respectively. According to the ratio of reducing sugar and total sugar, the variation regularity of av⁃erage polymeric degree of the enzymatic hydrolysates were obtained. The influence factors in the enzymatic process were studied, and the optimal conditions for alginate degradation by the recombinant alginate lyase were determined. The results showed that optimalco nditions for enzymatic hydrolysis were: temperature 25 ℃, pH 7�5, initial substrate concentration 7 g/L, enzyme 0�48 U, and reaction time 210 min. Under these condition, the concentration of reducing sugar reached 0�878 g/L and the average polymetric degree fell to 3 .The enzymatic hydrolysates were identified by mass spectrometer and the final products mainly included monosaccharide, disaccharide and tetrasaccharide.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(021)005【总页数】7页(P338-344)【关键词】褐藻胶;酶解;工艺优化;褐藻胶寡糖;聚合度【作者】王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【作者单位】集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S188我国海藻资源丰富。
褐藻胶裂解酶及其裂解产物的研究进展
食品研究与开发２００６．Ｖｏｌ．２７．ＮＯ．１１褐藻胶是褐藻酸盐、褐藻酸及其衍生物的统称，是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻间质中提取的多糖聚合物。
主要由１，４－β－Ｄ－甘露糖醛酸（Ｍ）及其Ｃ５差向异构体１，４－α－Ｌ－古罗糖醛酸（Ｇ）两种糖醛酸单体聚合而成。
聚合方式有四种：可以由多聚β－Ｄ－甘露糖醛酸（ＰｌｏｙＭ）或多聚α－Ｌ－古罗糖醛酸（ＰｌｏｙＧ）构成均聚物，也可以由ＭＧ交替（ＰｏｌｙＭＧ）或Ｍ、Ｇ以不同比例随机构成杂聚物［１］。
近年来，褐藻胶的开发利用引起了人们广泛重视，对褐藻胶裂解酶及其降解产物的研究成为热点。
本文就这两方面作较为详细的总结与阐述。
１褐藻胶裂解酶１．１来源褐藻胶裂解酶主要有三个来源：第一类是动物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋软体动物和棘皮动物等。
１９８４年，国内的朱仁华等［２］从朝鲜花冠小月螺、单齿螺和褐疣荔枝螺３种海螺中分离得到褐藻胶裂解酶的粗酶提取液，用粘度法测定了酶活力，尤以朝鲜花冠小月螺的分解活性最高。
１９８７年，Ｋｌｏａｒｅｇ等［３］从海兔内脏中制备出褐藻酸酶，用于墨角藻合子的去壁，制备出了原生质体。
１９８９年，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等［３］从海螺、鲍的内脏中制备出褐藻解壁酶，用于某些褐藻的细胞解离。
第二类是植物源的褐藻胶裂解酶，包括巨藻、泡叶藻、掌状海带、克氏海带等海藻。
１９６６年，ＬｉｎＹ．Ｔ．等［４］从海洋褐藻ＦｕｃｕｓｇａｒｄｎｅｒｉＳｉｌｖａ中分离提纯出褐藻酸酶。
１９９９年，Ｋｒａｉｗａｔｔａｎａｐｏｎｇ等［５］自腐败海藻ｋｏｍｂｕ中分离出一株褐藻胶酶高产菌Ｎ－１，并对其降解酶基因进行了克隆和测序。
第三类是微生物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋细菌、土壤细菌和真菌等。
１９８４年，Ｊｅｆｆｒｅｙ等［６］以褐藻酸钠为惟一碳源，从土壤和海水中分离出产生褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌，胞外酶表现出明显的内切甘露糖醛酸裂解酶性质，酶的分子量约为４０ｋＤ。
２００１年，Ｉ－ｗａｍｏｔｏ［７］等人研究发现埃氏别单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）可以产生一种褐藻酸胞内裂解酶，分子量为３３．９ｋＤ，ｐＩ为３．８，在ｐＨ７．５￣８．０时，具有最高活性。
海洋微生物 海藻酶解液中抗肿瘤活性物质的筛选及其活性机理的
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主要分为以下几点： 主要分为以下几点：
1 2 3
褐藻胶裂合酶的制备
制备酶解液，提取寡糖复合物并分离纯化 体内外实验检测寡糖的癌细胞毒活性
单击此处编辑母版标题样式 三、技术及技术路线
褐藻胶裂合酶的制备
海带或其干粉
制备酶解液 提取寡糖复合物 寡糖的分离纯化 体内外实验检测寡糖的癌细胞毒活性
注射小浓度寡糖
接 种
停药
昆明小鼠培养 （ 3 组）
注射大浓度寡糖
摘除眼球 取血 分离血清
注射生理盐水
脱颈 称瘤重
抑瘤率
胸腺， 剖取 胸腺，脾脏
胸腺指数 脾指数
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培养肺癌细胞 单细胞悬液
接种于培养瓶
取对数生长期 细胞
接种于 96 孔 培养板
加 入 寡 糖（设对 照组） 照组）
MTT 法
乙 醇
真空抽滤收集沉淀物
褐藻胶酶解产物
结构鉴定
色 谱 法初 步 分 离成不同组分
褐藻寡糖分子量测定（ 技术） 褐藻寡糖分子量测定（ GPC 技术）
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2.体内外实验检测寡糖的癌细胞毒活性 体内外实验检测寡糖的癌细胞毒活性
肝癌细胞培养 传代 培养 稀释为细胞 菌悬液 昆明小鼠培养 脱臼处死
海藻酶解液中抗肿瘤活性物海藻酶解液中抗肿瘤活性物海藻酶解液中抗肿瘤活性物质的筛选及其活性机理的质的筛选及其活性机理的质的筛选及其活性机理的初步探究初步探究初步探究海藻酶解液中抗肿瘤活性物海藻酶解液中抗肿瘤活性物海藻酶解液中抗肿瘤活性物质的筛选及其活性机理的质的筛选及其活性机理的质的筛选及其活性机理的初步探究初步探究初步探究分工
通过调动机体免 疫系统、 疫系统、激活自 身免疫细胞来杀 1.手术风险较大。 手术风险较大。 手术风险较大 对人体毒副作用 强， 伤肿瘤细胞。 伤肿瘤细胞。但 2.对人体创伤较大 对人体创伤较大 如损伤各大 机理未完全清楚， ，使患者的免疫力降 机理未完全清楚， 脏器。放疗治疗 脏器。 疗法还未成熟， 疗法还未成熟， 低，易出现一系 费用较高， 费用较高，一般 目前只是处于试 列并发症。 列并发症。 家庭难以支付 验阶段。 验阶段。 3.复发率极高。 复发率极高。 复发率极高 4.有种植的可能 有种植的可能
褐藻寡糖的酶法制备及其在水产养殖中的应用
褐藻寡糖的酶法制备及其在水产养殖中的应用
黄哲;胡睿同;王连顺;丛玉婷;卢亚楠;王丽;王华;杨国军
【期刊名称】《饲料研究》
【年(卷),期】2024(47)2
【摘要】褐藻寡糖(AOS)是一类由2~10个单糖分子经相同或不同糖苷键连接而成的低分子量聚合物。
褐藻胶裂解酶是酶法制备AOS的重要工具,酶法制备的AOS在纯度、性能、结构方面优于其他方法制备的AOS。
文章综述了褐藻胶裂解酶的来源、结构及酶学性质,总结了酶法制备的AOS在饲料添加剂、微藻培育、免疫调节、抗氧化和抗菌等水产养殖方面的应用,对褐藻胶裂解酶的研究方向以及AOS在水产养殖中的应用前景进行了展望,为褐藻胶裂解酶、AOS在水产养殖中的应用提供参考。
【总页数】7页(P139-145)
【作者】黄哲;胡睿同;王连顺;丛玉婷;卢亚楠;王丽;王华;杨国军
【作者单位】大连海洋大学水产与生命学院;设施渔业教育部重点实验室(大连海洋大学);辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】S963
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1.酶解制备褐藻胶寡糖及其产物的抗氧化活性分析
2.低分子质量褐藻寡糖的高效酶法制备及其抗氧化活性评价
3.酶解褐藻寡糖的分离制备及其脂蛋白调节作用
4.酶
解制备褐藻寡糖工艺优化及活性研究5.黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用
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褐藻胶低聚糖的保水性和抗氧化功能研究
3种褐藻多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究毕业论文-开题报告
3 种褐藻多酚类成分的提取分离和抗氧化活性研究
学
号
201011221115 姓名
李源
院(系)
食品科技学 院
专业 食品质量与安全
指导教师
卢虹玉
所在单位、部门
食品科技学院食品 质量与安全系
职称
讲师
萃取法、吸附树脂法、高速逆流色谱法和有机溶剂萃取法等。国内外报道的测定褐藻多酚抗氧化物质
清除自由基的方法主要有紫外-可见光分光光度法、化学发光法、电子自旋共振法、电化学检测法、荧
湛江作为我国大型海藻资源地之一，有着丰富的褐藻资源，尤其是硇洲马尾藻为湛江特有，且少见
相关研究的报道。这样的资源不加以利用太过于可惜和浪费。不同种类的褐藻中褐藻多酚的含量差距
很大，与藻体的大小、年龄、组织、盐度、季度、营养条件、光照条件及采摘后的保存时间和条件都
有关系。因此本课题选取 3 种典型的湛江产马尾藻：硇洲马尾藻、硇洲产铜藻和鲜鱼头草，提取褐藻
and HPLC-MS using amonolithic reversed-phase column[J].Journal of Pharmaceuticaland Biomedical
Analysis,2007,43 (2):481-485.
[23]. 张嫩玲,马青云,胡江苗等. 小茴香根的化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2011,23
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[22]. Krizman M,Baricecie D,Prosek M. Determination of phenolic compounds in fennel by HPLC
酶法制备壳寡糖工艺优化及抗氧化能力分析
酶法制备壳寡糖工艺优化及抗氧化能力分析【摘要】本文通过酶法制备壳寡糖工艺的优化及抗氧化能力分析，旨在探讨壳寡糖在抗氧化领域的潜在应用价值。
文章介绍了研究的背景、目的和意义，为后续内容铺垫。
接着，详细阐述了酶法制备壳寡糖的工艺流程优化和影响因素分析，为壳寡糖的后续研究奠定了基础。
随后，通过抗氧化能力测试方法和影响因素分析，揭示了壳寡糖在抗氧化方面的潜在机制。
结合研究结果进行总结，提出了工艺优化建议，并就壳寡糖的抗氧化能力进行了详细结论。
本研究为壳寡糖的应用提供了理论依据，并为其在抗氧化领域的进一步研究和应用提供了有益的参考。
【关键词】酶法制备、壳寡糖、工艺优化、抗氧化能力分析、影响因素、抗氧化活性、抗氧化机制、研究结果、工艺建议、抗氧化能力结论1. 引言1.1 研究背景目前对于酶法制备壳寡糖的工艺优化和抗氧化能力的研究还比较有限。
在现有的研究中，往往只注重了工艺参数的调控，而对于一些影响因素以及抗氧化机制的研究还未深入探讨。
本研究旨在通过对酶法制备壳寡糖的工艺流程进行优化，分析影响因素，并测试其抗氧化能力，深入探究壳寡糖的抗氧化机制，为其进一步开发和利用提供科学依据。
研究壳寡糖的抗氧化能力不仅可以拓展其在药物和保健食品领域的应用，还有助于深入了解其在生物体内的作用机制，为开发新型抗氧化剂提供理论依据。
本研究具有重要的科学研究意义和应用前景。
1.2 研究目的本研究旨在通过酶法制备壳寡糖的工艺优化及抗氧化能力分析，深入探讨壳寡糖在抗氧化领域的潜在应用价值。
具体目的包括：1. 探讨不同工艺条件下酶法制备壳寡糖的最佳条件，提高产品纯度和产率；2. 分析影响酶法制备壳寡糖的关键因素，为生产实践提供科学依据；3. 建立壳寡糖的抗氧化能力测试方法，全面评估其抗氧化效果；4. 分析不同因素对壳寡糖抗氧化活性的影响，揭示其抗氧化机制；5. 结合研究结果，为壳寡糖的应用提供理论支持和工艺优化建议，推动其在抗氧化产品领域的进一步开发和应用。
黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用
黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用江君1，刘军1，杨绍青1，马帅1，闫巧娟2，江正强1,*（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，中国轻工业食品生物工程重点实验室，北京100083；2.中国农业大学工学院，北京100083）摘 要：研究黄杆菌褐藻胶裂解酶基因（rFlAlyA）在枯草芽孢杆菌中的高效表达，高密度发酵48 h最高酶活力为2 550 U/mL，蛋白质量浓度达4.5 mg/mL。
经(NH4)2SO4沉淀和SP强阳离子交换柱纯化后得到电泳级纯酶，分子质量约为30 kDa。
褐藻胶裂解酶rFlAlyA最适pH值为7.5，在pH 4.0～11.0范围内可保持80%以上酶活力；最适温度为50 ℃，在50 ℃及以下可保持80%以上酶活力。
底物特异性分析表明，rFlAlyA特异性降解聚甘露糖醛酸片段，最短链底物为甘露糖醛酸三糖。
rFlAlyA在最适条件下酶解褐藻酸钠4 h后还原糖质量浓度达33 mg/mL，底物转化率为70.1%，电喷雾电离-质谱分析酶解产物的聚合度（degree of polymerization，DP）为1～8，离子色谱分析显示DP=3时相对含量最高，为34.0%。
结果表明，经枯草芽孢杆菌高效表达的rFlAlyA可用于制备褐藻寡糖。
关键词：褐藻胶裂解酶；黄杆菌；枯草芽孢杆菌；高密度发酵；褐藻寡糖High Level Expression of Alginate Lyase from Flavobacterium sp. and Its Application in Preparation of Alginate Oligosaccharides JIANG Jun1, LIU Jun1, YANG Shaoqing1, MA Shuai1, YAN Qiaojuan2, JIANG Zhengqiang1,*(1. Key Laboratory of Food Bioengineering (China National Light Industry), College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China) Abstract: High-efficiency expression of the alginate lyase gene (rFlAlyA) from Flavobacterium sp. in Bacillus subtilis was studied. After high cell-density fermentation for 48 h, the enzymatic activity reached the highest level of 2 550 U/mL with a protein content of 4.5 mg/mL. The rFlAlyA, with a molecular mass of about 30 kDa, was purified to electrophoretic homogeneity after fractionation with (NH4)2SO4 and ion exchange chromatography on SP strong cation exchange column. Maximal enzymatic activity was observed at pH 7.5 and 50 ℃. The enzyme showed good stability at pH 4.0−11.0 and was thermostable up to 50 ℃, retaining over 80% of its activity. The substrate specificity indicated that rFlAlyA was a polymannuronate lyase with trisaccharide being the shortest-chain substrate. For alginate oligosaccharides production, sodium alginate was reacted with rFlAlyA under the optimal conditions for 4 h, giving a final concentration of reducing sugar of 33 mg/mL in the reaction mixture and a conversion rate was 70.1%. Electrospray ionization tandem mass spectrometry showed that the degree of polymerization (DP) of the hydrolysates was 1 to 8 and trisaccharide was the most abundant, which accounted for 34.0% of the total components when the DP was 3. The findings of this study indicated that the recombinant alginate lyase could be applied for the production of alginate oligosaccharides.Keywords: alginate lyase; Flavobacterium sp.; Bacillus subtilis; high cell-density fermentation; alginate oligosaccharidesDOI:10.7506/spkx1002-6630-20191213-149中图分类号：Q814 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）04-0145-08引文格式：江君, 刘军, 杨绍青, 等. 黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用[J]. 食品科学, 2021, 42(4): 145-152. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191213-149. JIANG Jun, LIU Jun, YANG Shaoqing, et al. High level expression of alginate lyase from Flavobacterium sp. and its application in preparation of alginate oligosaccharides[J]. Food Science, 2021, 42(4): 145-152. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191213-149. 收稿日期：2019-12-13基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2017YFD0400204）第一作者简介：江君（1995—）（ORCID: 0000-0001-9267-0500），男，博士，研究方向为食品生物技术。
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酶解制备褐藻胶寡糖及其产物的抗氧化活性分析周绪霞;徐鋆;丁玉庭【摘要】以褐藻酸钠为底物,通过褐藻胶裂解酶酶解方法得到3种不同分子质量范围的褐藻胶寡糖组分(ADO-A、ADO-B和ADO-C),对其抗氧化性活性进行了研究.结果表明:3种寡糖组分都有一定的抗氧化活性,且活性随着寡糖浓度的增加而加强,其中ADO-C的抗氧化活性最高.在DPPH·体系中,ADO-C的IC50值为0.53mg/mL;在·OH体系中,ADO-C对羟基自由基的清除活性大干同浓度的抗坏血酸(P ＜0.05)；还原力方面,在较低的浓度下,ADO-C表现出的还原力显著大于其余的2种(P＜0.05).实验表明,酶解得到的褐藻胶寡糖具有较强的抗氧化性,ADO-C(MW＜8000)的抗氧化性最显著,即分子质量较小的寡糖有更强的抗氧化活性.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2014(040)002【总页数】5页(P116-120)【关键词】褐藻胶寡糖;酶解;抗氧化性【作者】周绪霞;徐鋆;丁玉庭【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州,310014【正文语种】中文褐藻胶(Alginate)是一种由β-1，4-D-甘露糖醛酸(M)和α-1，4-L-古罗糖醛酸(G)2 种单体通过1，4-糖苷键链接而成的线性多糖聚合物，主要来自于海带、马尾藻、巨藻等褐藻类植物，具有抗肿瘤、增强免疫、促生长等多种生理活性，但由于其自身是一种高聚合度的物质，分子质量较大，不易溶解，且黏度较大，实际应用有一定的局限性［1］。
褐藻胶分子结构中含有大量的羟基，酶解可以改变糖分子伸展结构，使糖羟基暴露，改善其性能。
褐藻胶寡糖是褐藻胶的降解产物，是由2～10个单糖分子通过糖苷键连接而成的聚合物，由于其相对分子质量低，具有溶解性能好、机体吸收利用率高、稳定性好等特性［2］。
研究表明，生物活性多糖包括鼠尾藻多糖、浒苔多糖、褐藻胶及其衍生物、甲壳质及其衍生物都具有较好的清除自由基活性或体内抗氧化活性，说明褐藻胶寡糖在抗氧化方面具有很好的研究价值［3］。
目前已有从锈凹螺［4］、Flavobacterium sp.LXA［5］、Vibrio sp.510［6］等来源的褐藻胶裂解酶制备褐藻胶寡糖的研究。
本实验室筛选得到了1株能够产生褐藻胶裂解酶的琼氏不动杆菌，目前已经对其酶解特性和酶解产物的抗氧化活性(氧自由基吸收能力，ORAC)进行了研究，结果表明该酶制备的褐藻胶寡糖具有较强的氧自由基吸收能力［7］。
本研究在此基础上，根据分子质量大小对该裂解酶酶解褐藻酸钠的寡糖产物进行了粗分级，对不同分子量范围的酶解褐藻胶寡糖的抗氧化活性，包括DPPH·清除活性、·OH清除活性和还原力，进行了比较分析。
1 材料与方法1.1 实验材料褐藻胶裂解酶:从本实验室储藏的琼式不动杆菌中分离纯化得到，经冷冻干燥制备酶粉(酶活性4.9×103U/g);海藻酸钠:温州市化学用料厂(纯度＞99%);DPPH(J＆K SCIENTIFIC);葡聚糖标准品(分子量5 kDa和80 kDa，sigma公司);其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验仪器PHS-3C pH计，上海精科仪器有限公司;CR21GⅡ高速冷冻离心机，Hitachi Kokico，Ltd.Japan;超生波细胞破碎仪，53 CHURC HILL RDNEWTOWN.U.S.A);恒温培养振荡器(ZHWY-200B)，上海智城分析仪器制造有限公司;膜分离设备(LNG-NF-101)，上海朗极膜分离设备工程有限公司;UV759型紫外可见分光光度计，上海奥谱勒仪器有限公司;高效液相色谱仪1525，美国Waters公司。
1.3 实验方法1.3.1 酶解制备褐藻胶寡糖向100 mL 5%的褐藻酸钠水溶液中加入4 mL褐藻胶裂解酶酶液(1 000 U/mL)，在30℃下酶解24 h，期间不断搅拌并每隔2 h取2 mL酶解液，经10 min沸水浴灭酶后进行HPLC分析。
酶解24 h的样品8 000r/min离心10 min，取上清液，得到褐藻胶寡糖的混合溶液，使用截留分子质量8 kDa的超滤膜进行超滤分离，得到粗分级的寡糖样品，样品冷冻干燥后进行抗氧化活性分析。
1.3.2 褐藻胶寡糖的HPLC分析HPLC条件:色谱仪:高效液相色谱仪1525(美国Waters公司);色谱柱:TSK-gelG4000 PWxl色谱柱(7.8mm×30 cm);检测器:示差检测器(RID);流动相:蒸馏水;流速1.0 mL/min;柱温40℃;进样体积20 μL。
1.3.3 褐藻胶寡糖抗氧化性活性测定DPPH·清除率测定［8］:向试管中加入2 mL含0.15mmol/L的DPPH的95%乙醇，并加入2 mL抗氧化剂，混合振荡后，在室温下暗处放置30 min。
测定反应液在517 nm处的吸光值，记为Ai。
将蒸馏水代替抗氧化剂测定，记为Ac。
将乙醇代替DPPH溶液测定，记为Aj。
则清除率R值计算公式为:·OH清除率测定［9］:反应体系中依次加入9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL、9 mmol/L FeSO41 mL和不同浓度的褐藻胶寡糖溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O21 mL启动反应。
反应启动后，立即转入37℃水浴锅内恒温反应30 min，于510 nm处测得不同褐藻胶寡糖浓度下的吸光值，以9 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，样品1 mL和双蒸水1 mL作为样品的本底吸收值。
清除率计算:式中:Ao为空白对照液的吸光度;Ax为加入样品后的吸光度;Axo为样品本底吸收值。
还原力测定［10］:2 mL样品加到2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和2 mL 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。
混合物在50℃保温20 min，然后在反应混合物中加入2 mL 10%的TCA溶液，混合后8 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL与2 mL蒸馏水以及0.4 mL 0.1%FeCl3溶液在反应试管中反应，10 min后测定700 nm处的吸光值。
数据统计分析:采用SPSS18.0进行数据分析;当P＜0.05时，存在显著性差异。
2 结果与讨论2.1 褐藻酸钠酶解产物HPLC分析由图1可以看出，酶解2h和24 h的褐藻酸钠酶解液的HPLC峰形相似，均得到3个主峰，前2个峰的出峰时间较早，分子量较大，而第3个峰与另2个峰的出峰时间相差较大。
与2h酶解液相比，24 h酶解液前2个峰的保留时间稍有延迟，第3个峰的保留时间基本不变;在相对峰面积上，3个峰之间有明显的改变，第1个峰明显减小，其余2个峰明显增大，说明大分子寡糖不断降解产生小分子寡糖。
随着时间的增加，酶解产物的峰形没有发生明显变化，从这个角度考虑，该种褐藻胶裂解酶对海藻酸钠的酶解有较强的特异性，酶解得到的小分子物质较为单一，随着酶解时间的增加，并不能酶解产生更多种类的小分子物质。
图1 褐藻胶酶解2h和24 h后的色谱图Fig.1 Chromatogramm of degradation of alginate by alginate lyase for 2h and 24 h在相同色谱分析条件下，分子量为5 kDa和80 kDa的葡聚糖标准品的保留时间分别为11.56和9.07 min，由此推测，酶解液中出峰时间在11.76和11.8 min时的物质其分子量小于5 kDa，而另外2种物质的分子量则均在8 kDa以上，因此下一步试验将通过8 kDa的超滤膜对酶解产物进行粗分离分析。
表1 酶解寡糖的出峰保留时间、峰面积比较Table 1 The retention time and peak area of ADO after enzymolysis酶解时间/h 编号保留时间/min 相对峰面积/%5.40 61.01 2 2 6.34 3.09 1 3 11.76 35.90 5.99 36.28 24 2 6.96 19.89 1 3 11.81 43.832.2 膜分离不同分子量的褐藻胶寡糖对酶解24 h后的酶解液使用8 kDa的超滤膜进行初步分级后，得到两类不同分子量的寡糖组分ADO-A、ADO-C以及酶解24 h后的混合寡糖ADO-B(以下表述中ADO-C为由分子量小于8 kDa寡糖组成的混合组分，ADO-B为未进行分子量分级的酶解产物混合组分，ADO-A为由分子量大于8 kDa的寡糖组成的混合组分)。
2.3 不同分子质量范围褐藻胶寡糖组分的抗氧化活性2.3.1 DPPH·清除活性DPPH体系常被用来衡量物质的抗氧化能力。
DPPH·在有机溶剂中有很强的稳定性，其分子结构中的孤对电子在自由基清除剂存在的情况下会被配对，从而在517 nm处的吸收强度会减弱，由此来检测物质的DPPH·清除能力的大小。
图2 ADO-A，ADO-B和ADO-C对DPPH·的清除活性Fig.2 Scavenging effects of ADO-A，ADO-B and ADO-C on DPPH·图2显示了粗分级的3种分子量范围的褐藻胶寡糖的DPPH·清除活性。
从图2可以看出，酶解后得到的3种不同组分的寡糖都具有一定的DPPH·清除活性，且活性随寡糖分子量的减小而增大。
3种寡糖的清除作用都随浓度的升高而增强，在同一浓度下，ADO-C对DPPH·的清除能力最强，其次为ADOB，最后为ADO-A。
其中，ADO-C在浓度1 mg/mL时对DPPH·的清除率就大于50%，而ADO-A浓度在5 mg/mL时清除率才超过50%。
图3显示了低浓度ADO-C对DPPH·的清除活性随浓度的变化规律。
由图3中可以得出，ADO-C对DPPH自由基的半抑制浓度IC50为0.53 mg/mL。
VC清除DPPH·的 IC50为0.004 7 mg/mL，抗坏血酸对DPPH自由基表现出极强的清除能力。
赵雪等［11］研究发现，琼胶寡糖对于DPPH的IC50为4 mg/mL。
而ADO-C的IC50值为0.53 mg/mL。
由此可见，ADOC清除自由基的能力虽与VC相差甚远，但高于琼胶寡糖。
由于氧的作用DPPH溶液通常以DPPH·和DPPH+两种形态的平衡态存在［12］。
所以，VC与寡糖类物质结构上的差异决定了清除自由基方式的差异，使得其最终表现出的清除能力也有明显的差异。