实验三、叶绿素含量的测定等

四、实验结果计算
将测定得到的吸光值代入下面的式子： 将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量 分别计算叶绿素a
VIS-723N可见分光光度计
比色皿校正和多波长测定 操作步骤： 1.在主菜单下选择“2 光度 测量”
1 2 3 4 5 6 主菜单 波长扫描 光度测量 定量分析 时间扫描 实时测量 系统设置 3.比色皿配对完成后，按“RETURN”键退 比色皿配对完成后， 键退 比色皿配对完成后 回光度测量参数设置界面。 回光度测量参数设置界面。 4.按F2开始测量。可按照屏幕上的提示进行 开始测量。 按 开始测量 测量操作，当有多个样品需要测量时， 测量操作，当有多个样品需要测量时，可测 完一个后再按“ 测下一个。 完一个后再按“F2”测下一个。注意样品的 测下一个 编号N值必须和比色皿的编号一致。 编号 值必须和比色皿的编号一致。 值必须和比色皿的编号一致
开机,按住电源开关1秒 探头从材料 上方匀速滑 过，等屏幕 显示出完整 叶片形状后 再次按红色 button结束测 量
选择显示方向
放入材料（不能直接接触探头） 按住探头上红 色button,直至发 出两种连续蜂鸣, 屏幕提示 “measure”可 开始测量
植物叶面积的测定（画纸称重法） 植物叶面积的测定（画纸称重法） 将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上， 用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电 子天平上称重，记为W1；另取10*10cm2的纸 片，称重记为W2；则所测叶片面积X可按下 面公式计算出。 X（cm2）＝W1/W2×100
二、材料：
大花老叶和嫩叶
三、实验步骤
1. 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料， 组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 ），混匀 2. 称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙 称取剪碎的新鲜样品0.5g 放入研钵中， 0.5g， 和石英砂及2 3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml 10ml， 和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗 处静置3 5min。 处静置3～5min。 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒 取滤纸1 置漏斗中，用乙醇湿润， 入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、 25ml棕色容量瓶中 入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、 研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量 用滴管吸取乙醇， 瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。 25ml，摇匀。 25ml，摇匀。 稀释5 后倒入光径1cm的比色杯内 光径1cm的比色杯内。 5. 把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的比色杯内。 把叶绿体色素提取液稀释 95％乙醇为参比，在波长665nm 649nm下测定光密度 665nm、 下测定光密度。 以95％乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。
D665=83.31Ca+18.60Cb……….(1) =83.31Ca+18.60Cb .(1) =24.54Ca+44.24Cb……….(2) D649=24.54Ca+44.24Cb .(2) 从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b 从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b 的浓度. 的浓度.
式中的D 为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时 注：(1)(2)式中的 665、D649为叶绿素溶液在波长 式中的 和 时 的光密度。叶绿素 、 的浓度单位为 的浓度单位为： 的光密度。叶绿素a、b的浓度单位为：g/L
分光光度计的基本维护及使用注意事项： 三、 分光光度计的基本维护及使用注意事项：
1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上， 能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。 能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。 2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。 3 仪器连续使用时间不应超过2小时，每次使用需歇半小 仪器连续使用时间不应超过2小时， 时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关， 时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下 插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。 插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。 4 千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。 千万不可用手、滤纸、 不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。 不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。 5 盛待液时，必须达到比色杯的2/3左右，不宜过多。用 盛待液时，必须达到比色杯的2/3左右，不宜过多。 2/3左右 完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。 完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。 6 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。 7 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线， 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线， 再选择最大峰的波长作为测定的波长 最大峰的波长作为测定的波长。 再选择最大峰的波长作为测定的波长。一般所制成的溶液 尽量使光密值在0.1 0.7的范围内测定。 0.1－ 的范围内测定 应尽量使光密值在0.1－0.7的范围内测定。
分光光度计的基本常识： 二 分光光度计的基本常识：
1、紫外光分光光度计，其使用波长在190－400nm, 波长在190－ 190 紫外光分光光度计， 可见光分光光度计， 波长在400－800nm。 400 可见光分光光度计，其使用波长在400－800nm。 2 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数， 浓度和波长等条件下物质的光吸收值， 表示。 浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。它取 决于溶质性质、入射光波长和温度。 决于溶质性质、入射光波长和温度。 消光度（也叫光密度OD，或吸光值A）：表示溶液吸收 消光度（也叫光密度OD 或吸光值A）：表示溶液吸收 OD， 光的强弱或吸收程度，也用E表示。 值愈大， 光的强弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液对光 吸收的程度愈大。 吸收的程度愈大。 透光率（用T表示） ：是透射光强度（透过比色皿）与 透光率（ 表示） 是透射光强度（透过比色皿） 表示 入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（ 入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用 T =It /I0表示） 。 表示）
实验三、 叶绿体色素含量的测定（ 实验三、 叶绿体色素含量的测定（分光光度法 SPAD叶绿素仪法 和SPAD叶绿素仪法 ）
高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素 ,其含 有的叶绿素 a和叶绿素 b能将光能转化为化学能 ,形成有机物质。 因此 ,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个 重要指标。 一、目的:
了解分光光度计和SPAD叶绿素仪的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体 色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。
要求：
2、问答题： （1 ）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表 定律又叫什么定律？ 定律又叫什么定律 达式（并说明各符号的代表意义）。 Lambert-Beer 达式（并说明各符号的代表意义）。 定律中的比例系数“ ”的物理意义是 ……？ 定律中的比例系数“K ”的物理意义是 ……？ LambertBeer 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？ 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？ （2 ）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰 为何 叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何 不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？ 不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？ （3）本实验为什么要用光路宽度为 的比色杯？ ）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？ 的比色杯
CB-1102便携式光合蒸腾测定仪
特点：
非破坏性测量，即不离体测量 具有开路和闭路测量两种光合测量方式 可以手动或自动测量，可编程自动定时测 量 全部测量参数和计算结果可以存贮，并通 过 RS232接口传输到计算机
注：此时，Ca、Cb为叶绿素 、b浓度，单位为 此时， 、 为叶绿素 为叶绿素a、 浓度 单位为:mg/L，利用上面（3）（ ） 浓度， ）（4） ，利用上面（ ）（
(5)式，即可以计算叶绿素a、b含量及总叶绿素的总含量 总)。 式 即可以计算叶绿素 、 含量及总叶绿素的总含量(G 。 含量及总叶绿素的总含量
二、原理
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a 和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同, b,二者的吸收光谱虽有不同 和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同, 但又存在着明显的重叠（如图） 但又存在着明显的重叠（如图）,在不 分离叶绿素a和叶绿素b 分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测 定叶绿素a和叶绿素b的浓度, 定叶绿素a和叶绿素b的浓度,可分别测 定在665nm 649nm的光吸收 665nm和 的光吸收, 定在665nm和649nm的光吸收, 由于在 该波长时叶绿素a 的比吸收系数K 该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为 已知，我们即可以根据Lambert Lambert已知，我们即可以根据Lambert-Beer 定律,列出浓度C与光密度D 定律,列出浓度C与光密度D之间的关系 式：
Chl（mg/g.FW） Chl（mg/g.FW）=
提取液体积 × × 稀释倍数÷ 样品鲜重 叶绿素的浓度 1000
原理： 原理：
SPADSPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。 940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。 测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在 这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区( 这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区(对光有较高的吸 收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低) 收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低)