凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量
面粉中淀粉、蛋白质含量的测定
⾯粉中淀粉、蛋⽩质含量的测定实验⽬的：⼀、实验⽬的1、利⽤酸⽔解法测定出⾷品中淀粉含量；2、利⽤凯⽒定氮法测定⾷品中蛋⽩质的含量。
实验原理：⼆、实验原理1、淀粉的测定原理：利⽤酸⽔解法测定⾷品中的淀粉，⾸先将⽶粉去脂肪及可溶性糖，接着加盐酸对⽶粉进⾏酸⽔解，利⽤滴定的⽅法检测⽔解后样品中还原糖，将还原糖换算成淀粉的含量。
2、蛋⽩质测定的原理：⾷品中的蛋⽩质在催化加热条件下被分解，产⽣的氨与硫酸结合⽣成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，⽤硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋⽩质的含量。
实验仪器及试剂：三、实验仪器及试剂1、仪器：天平、定氮蒸馏装置、烧杯、500mL与100mL容量瓶、滤纸、烧瓶、⽔浴锅、锥形瓶、玻璃珠、滴定管。
2、试剂：硫酸铜、硫酸钾、硫酸（1.84 g/L）、甲基红⼄醇溶液（1 g/L）、硼酸溶液（20 g/L）、混合指⽰液(2份甲基红⼄醇溶液(1g/L)+1份亚甲基蓝⼄醇溶液(1 g/L))、氢氧化钠溶液（400 g/L）、硫酸或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）、⼄醚、85%⼄醇、6mol/LHCl、40%NaOH、20%⼄酸铅、10%的NaSO4、碱性酒⽯酸铜液（甲、⼄液）。
实验步骤：四、实验步骤1、淀粉的测定实验步骤：（1）样品的处理：称取2.0~5.0克的⾯粉样品，将样品置于带有滤纸的漏⽃加⼊30ml⼄醚以除去⾯粉中脂肪，再⽤150ml的85%⼄醇分3次洗涤残渣以除去可溶性糖，滤⼲，接着⽤100ml⽔洗涤残渣后将残渣移⾄烧瓶，加⼊30ml的6mol/L的HCl⾄烧瓶中，⽤沸⽔浴冷凝回流40min，接着⽤流⽔冷却后⽤碘液鉴定是否充分⽔解，直⾄⽔解充分，冷却后加⼊甲基红及40%的NaOH调⾄黄⾊，⽤6mol/L的HCl校正⾄刚好变红，加⼊20ml20%的⼄酸铅，摇匀放置10min，接着加⼊20ml10%的NaSO4摇匀，将滤液及残渣移⼊500ml容量瓶定容，接着过滤同时弃去最初的20ml滤液，取滤液20ml加⼊到100ml的容量瓶中定容，则样液制备完成备⽤；（2）标定碱性酒⽯酸铜液：吸取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加⽔20ml，玻璃珠2颗，滴加9ml葡萄糖标准液，控制在2min内加热⾄沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准液，直⾄溶液刚好褪⾊（平⾏三次取平均值）计算10ml（甲、⼄液各5ml）碱性酒⽯酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）A1；（3）样品液预测：取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，加20ml的⽔以及两粒玻璃珠⾄250ml的锥形瓶中，加热⾄沸腾，⽤样品液趁沸先快后慢滴定⾄褪⾊；（4）样品溶液的测定：取碱性酒⽯酸铜甲、⼄液各5ml，加20ml的⽔以及⽐预测体积少1ml的样品溶液，另加⼊两粒玻璃珠，加热⾄沸腾，⽤样品液趁沸继续以1d/s的速度滴⾄褪⾊（平⾏三次，取平均值V1）。
凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤
一、引言定氮法是一种常用的测定粗蛋白质含量的方法，而凯氏定氮法则是其中的一种常用方法。
在食品、饲料、肥料等领域，粗蛋白质的含量是一个重要的指标，对其进行准确的测定具有重要的意义。
本文将重点介绍凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤。
二、凯氏定氮法的基本原理凯氏定氮法是利用样品中的蛋白质中所含的氮原子来进行测定，其基本原理是将样品中的蛋白质分解成氨基酸，然后将氨基酸中的氮测定出来，从而计算出样品中蛋白质的含量。
具体步骤包括将样品中的蛋白质分解成氨基酸、使氨基酸中的氮转化为氨，然后将氨转化为氮气，最终用氮气进行测定，从而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的主要测定步骤1. 样品的预处理样品在进行测定之前，需要进行预处理，包括粉碎、称取等操作，以保证样品的代表性和准确性。
2. 样品的消解将样品中的蛋白质分解成氨基酸，通常采用氢氧化钠、硫酸等消解剂，将样品中的有机氮转化为氨基酸中的氮。
3. 氮的转化将氨基酸中的氮转化为氨，通常采用氢氧化钠、碳酸盐等转化剂来实现。
4. 氨的转化将氨转化为氮气，通常采用硼酸、氢氧化钠等转化剂来实现。
5. 氮的测定用高纯氮气进行氮的测定，通常采用凯氏装置来收集和测定氮气中的氮含量。
6. 计算粗蛋白质含量根据测定得到的氮含量，结合样品的系数，计算出样品中粗蛋白质的含量。
四、凯氏定氮法的优缺点1. 优点凯氏定氮法具有操作简便、结果准确、适用范围广等优点，特别适用于大批量样品的快速测定。
2. 缺点凯氏定氮法在样品需消解的时间较长、对转化剂和试剂的要求较高等方面存在一些缺点，同时测定过程中易受外界环境的影响。
五、结语凯氏定氮法作为一种常用的测定粗蛋白质含量的方法，在食品、饲料、肥料等领域具有重要的意义。
通过本文的介绍，相信大家对凯氏定氮法测定粗蛋白质的基本原理及主要测定步骤有了更加全面的了解。
认真掌握凯氏定氮法的操作技巧，能够准确快速地测定出样品中粗蛋白质的含量，为相关行业的质量监控和产品研发提供有力支持。
凯式定氮法
凯式定氮法检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。
一、原理将样品与浓硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出, 样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，加碱将消化液碱化，通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，使硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
消化反应为：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入催化剂，如硫酸钾、硫酸铜。
1、硫酸钾。
加入硫酸钾的目的是为了提高溶液的沸点。
加快有机物的分解。
硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可以提高反应温度，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸氢钾的浓度不断升高。
但加入的硫酸钾的量不能太大，否则消化体系温度过高，会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失。
2、硫酸铜。
硫酸铜的作用机理如下：Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2+CO2此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜（Cu2SO4褐色）生成，溶液呈现清澈的Cu2+的蓝绿色。
故硫酸铜除了起催化剂作用外，还可指示消化终点，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
蒸馏：在消化完全的样品消化液中加入浓氢氧化钠使其呈碱性，此时氨游离出来，加热蒸馏即可释放出氨气，反应如下：(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO4吸收与滴定：蒸馏所释放出来的氨，用硼酸溶液进行吸收，硼酸呈微弱酸性，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，吸收及滴定反应为：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3二、仪器和试剂凯氏烧瓶、定氮蒸馏装置浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠溶液、盐酸标准溶液、硼酸吸收液、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。
生化实验05凯氏定氮法
可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果， 当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。
1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，
加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管 口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低 ，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体 达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。
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二、材料、仪器设备及试剂
材料：苞菜或其他果蔬
仪器设备：蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定
管、漏斗、移液管等
试剂：
1. 2%草酸；
2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）；
3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制）
2,6-二氯酚靛
酚溶液（蓝
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（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL）
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四、数据记录
W= g（根据样品管编号在讲台上查表获得）； VT= mL; Vs= mL; A= mL；B= 0.2 mL
五、结果计算
样品总氮含量（%）= C ( A B) 14 VT 100 W VS 1000
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三、实验步骤
3. 染料标定 取10 mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶
蛋白质制备及含量测定（凯氏定氮法）分析
蛋⽩质制备及含量测定（凯⽒定氮法）分析实验六蛋⽩质制备及含量测定——微量凯⽒（Mirco-Kjeldahl）定氮法⼀、实验⽬的要求1、了解蛋⽩质提取的⼀般⽅法和原理2、了解蛋⽩质含量测定的常⽤⽅法3、学习微量凯⽒定氮法的原理4、掌握微量凯⽒定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋⽩质含量的换算等。
⼆、实验原理1、蛋⽩质的提取与制备蛋⽩质的提取与制备⽅法与⽣物材料的类型及蛋⽩质的存在部位有关。
如果是胞内蛋⽩，⾸先必须要进⾏细胞破碎。
细胞破碎的⽅法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋⽩，可以根据相应蛋⽩质的性质进⾏提取分离纯化。
如果待提取的蛋⽩质是具有⽣物活性的蛋⽩质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防⽌蛋⽩质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋⽩质含量测定蛋⽩质含量测定的⽅法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染⾊法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯⽒定氮法等。
3、凯⽒定氮⽣物材料的含氮量测定在⽣物化学研究中具有⼀定的意义，如蛋⽩质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋⽩含量。
⽣物材料总氮量的测定，通常采⽤微量凯⽒定氮法。
凯⽒定氮法由于具有测定准确度⾼，可测定各种不同形态样品等两⼤优点，因⽽被公认为是测定⾷品、饲料、种⼦、⽣物制品、药品中蛋⽩质含量的标准分析⽅法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为⽆机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提⾼硫酸沸点。
这⼀步约需2～3h，视样品的性质⽽定。
天然的含氮有机物（如蛋⽩质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢⼆元素被氧化成⼆氧化碳和⽔；蛋⽩质分解，⽽有机氮则变成氨（⽆机氮），并进⼀步与硫酸作⽤⽣成硫酸铵。
此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进⾏得⽐较缓慢，通常需要加⼊硫酸钾或硫酸钠以提⾼反应的沸点，并加⼊硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进⾏。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
结语
食品行业的飞速发展与人们对食 品安全的愈加重视都给食品质量检测 提出更高的要求，作为质量检测的从 业者，需对食品进行更加严格和准确 的检测。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
□ 石红伟 大连普兰店市产品质量监督检验所
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食品安全导刊
2016年11月
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.33.091 越来越多的人开始关注自身健康 与食品安全问题，精确地测定食品中 蛋白质含量对食品质量检测、食品安 全 都 极 为 重 要。 新 的 国 家 标 准《 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定》（ＧＢ／Ｔ ５００９．５－ ２０１０）给出凯氏定氮法、分光光度法 和燃烧法 ３ 种可用于食品中蛋白质的 检验方法。其中凯氏定氮法在现阶段 检测中的使用最为广泛，其具有适用 范围广，检测试验重现性好，准确度 和灵敏度高， 被测样品用量少等优点， 因此本文主要具体介绍凯氏定氮法的 步骤和原理并分析其误差。
T
echnology
科技
分析与检测
的蒸发效率和吸收程度都直接决定检 测结果的准确度。 滴定 滴定主要目的定量测量蒸馏得到 的溶液中的铵根离子。其基本原理是 利用弱碱性的硼酸铵与强酸反应生成 铵盐和硼酸。一般采用已知浓度的稀 盐酸或稀硫酸对溶液进行滴定试验， 根据消耗的 ＨＣｌ 或 Ｈ２ＳＯ４ 的量计算出蒸 馏后溶液中氨的含量，折算成样品中 氮元素的含量，从而根据蛋白质中氮 元素的比例，通过计算得到被测样品 中蛋白质的含量。 F＝６．２５。 多次测量取平均值减小偶然误差 整个测量中涉及大量试剂的配制 使用，操作与读数，各种环境因素的 干扰等，这些都会使测量中产生偶然 误差，因此在蛋白质含量的测量中， 最终测量结果需要进行多次重复性试 验，并将得到的结果取算数平均值表 示， 以 此 减 小 测 量 的 偶 然 误 差， 并 且 如 果 待 测 样 品 蛋 白 质 的 含 量 即： Ｘ ≥ １ ｇ／１００ ｇ，其结果需要保留三位 有效数字；如果待测样品蛋白质的含 量即：Ｘ ＜ １ ｇ／１００ ｇ，其结果只需要 保留两位有效数字即可。 其他含氮物质的干扰 通过凯氏定氮法的基本原理与操 作步骤可发现，使用该方法检测时， 第一步消化的本质是将样品中的氮元 素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮 法测量的是被测样品中有机物中含有 氮元素的总量，因此该办法并无法消 除样品中其他有机物中含有的氮元素 对测量结果的影响，如尿素、三聚氰 胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检 测方法便为凯氏定氮法，最终未能检 测出原料中的三聚氰胺而导致食品安 全事件。除去样品中非蛋白质部分有 （１） 机物中氮元素对整个测量的影响，要 先去除非蛋白质中的氮元素再进行具 体测量，或用其他方法测出非蛋白质 中的氮含量，再用总氮含量减去该值 再进行折算。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法在化学分析中的应用摘要：蛋白质是生命的物质基础，一切有生命的东西都含有不同类型的蛋白质。
蛋白质又是食品的重要组成之一，也是食品中的营养素指标。
它是复杂的含氮有机化合物，其溶液是典型的胶体分散体系，有两性氨基酸以肽键相互连接而成。
蛋白质可以用酶、酸或碱水解，最终水解产物为氨基酸，其中赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸在人体内不能合成，称为必须氨基酸【1】。
他们对人体起很重要的生理功能作用。
在国家标准中，对蛋白质的测定一般采用凯氏定氮法。
下面对蛋白质、凯氏定氮法以及粮油中粗蛋白的测定进行说明。
关键词：凯氏定氮法、粗蛋白、粮油、测试蛋白质：蛋白质为人体补充蛋白质，是人体不可缺少的重要营养素，是唯一可帮助身体形成新组织的营养素，可制造肌肉、血液、皮肤和各种身体器官，蛋白质约占人体体重的20%。
最主要具有以下多种功效：1.提供多种氨基酸，帮助身体制造新的组织以替代老化组织抗衰老。
2.通过增加血红蛋白和胶原蛋白改善皮肤弹性和透明度红润度。
3.调节血液血红蛋白向细胞输送氧和各种营养素，促进机体生长。
4.调节体内水分的平衡。
5.为免疫系统制造对抗细菌和感染的免疫球蛋白和荷尔蒙。
6.在体内制造各种蛋白酶，有助将食物转化为能量，恢复疲劳。
7.均衡提高人体所需的八种必需氨基酸。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。
故各种不同的蛋白质含氮量也不同。
一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质。
此数值（6.25）称为蛋白质换算系数【2】。
不同种类的粮食油料其蛋白质换算系数也有所不同，如小麦为5.70，谷物及豆类为6.25。
在国家标准中粮食油料中粗蛋白质的测定采用凯氏半微量定氮法。
该法是1883年由丹麦化学家凯道尔（Johan、kjedahl）【3】创立的。
该方法适于以测定任何形态（固体、液体）的样品。
而且具有很高的准确度和精密度。
因此在食品分析、饲料分析、粮食品质分析及种子品质鉴定和生化研究工作中得到广泛应用。
凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析
实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。
2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。
二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H 形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。
然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。
吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2↑+12SO2↑ + 16H2O(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3三、样品：面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。
1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体)2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。
二组配500ml3. 40%NaOH溶液准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。
为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。
注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80℃后，方可加入30%浓度的双氧水。
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实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量
一、实验目的与要求：
1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。
2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。
二、实验原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。
然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。
吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 SO4 + 6CO2↑+ 12SO2↑ + 16H2O
(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3↑ + Na2SO4 + 2H2O
2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2 B4O7 + 5H2O
(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2NH4Cl + 4H3BO3
三、样品：面粉
四、仪器与试剂
仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W
试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。
1. 消化试剂：浓H2SO4 硫酸铜(固体) 硫酸钾(固体)
2. 2%硼酸(H3BO3)溶液: 10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。
二组配500ml
3. 40%NaOH溶液
4. 0.0100mol/L盐酸标准溶液
5. 混合指示剂: 临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用)
五、测定方法
1、样品消化：
准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5g CuSO4、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。
为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加4-5ml。
注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至70-80℃后，方可加入30%浓度的双氧水。
取50~60mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。
同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。
2、蒸馏与吸收：
⑴组装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸(呈黄色)，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
⑵将所有的夹子打开。
取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。
然后排出废水。
马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。
⑶量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，并加入 2滴混合指示剂，然后将此吸收液置于冷凝管下端插入到液面以下。
⑷将全部夹子打开，用移液管准确吸取10.0ml样品消化稀释液（或空白液），从样品加入口流入反应室内，用少量水(10ml)洗涤加入口，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。
将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，使反应室内的样液呈碱性，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防止氨的逸出。
⑸夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。
（6）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。
测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。
3．滴定：
用0.0100mol/L HCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。
平行实验进行数次。
同时吸取10.0mL 试剂空白消化液按上述操作做试剂空白试验。
注意：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。
洗净的标志：吸收液不变颜色
四、计算：
公式自己推导。
蛋白质% =
C — HCl标准溶液的浓度，mol/L；
V1—滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；
V2—滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；
m —面粉的质量， g；
0.01401－氮的毫摩尔质量；
F —小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70。
说明：参见书中P222
六、注意事项：
（1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。
（3）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL 后再继续加热消化。
（4）蒸馏装置不能漏气。
（5）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
（6）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。
以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（7）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min 后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。
（8）在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。
（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。