2021年慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
?2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、-80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒包装实验步骤及注意事项
慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。
但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。
慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。
慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。
以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。
将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。
2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）;Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine™LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix LipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀；e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：455 µl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15 µl PLUS Reagent 45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM 500 µl Total V olume500 µl Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
慢病毒包装实验技术方法
慢病毒包装实验技术方法1、实验试剂DMEM、超牛血清、G418、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、Lipofectamine TM 20002、实验仪器细胞培养板，37℃细胞培养箱，离心机，Amicon Ultra-15离心过滤器3、293FT细胞的培养用于包装病毒的293FT细胞必须处于生长旺盛期，细胞状态良好，细胞边缘清晰，传代次数较低。
293FT细胞培养：使用含10%超级新生牛血清的DMEM高糖培养基（并添加0.1mM的非必需氨基酸，2mM的L-谷氨酰胺，2mM的丙酮酸钠，500µg/ml的G418和1%的青霉素或链霉素），置于37℃、5% CO2 细胞培养箱中常规培养，保证细胞生长状态良好。
4、转染质粒细胞铺板：用含有10%FBS的无抗生素DMEM将生长旺盛的293FT细胞以一定密度铺到培养板中，使次日密融合度达到60%左右。
分别用脂质体作为转染试剂实现包装质粒和核心质粒的共转，PAX 2、pMD和核心穿梭质粒以3：1：4的比例用Lipofectamine TM 2000共转293 FT细胞。
转染6h后，移去细胞培养液，更换为新鲜的DMEM 培养基。
转染后24 h和48h分别于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照，效率应达到85%以上。
5、收集病毒转染48小时后收集含慢病毒的上清液于无菌的离心管中，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取离心后的上清分装到新的无菌的离心管中，-80℃冰箱保存。
将包装病毒的细胞培养板中加上新鲜的培养基，72h 后再次收获慢病毒上清液并离心处理后于-80℃保存。
6、慢病毒滴度测定慢病毒滴度测定：滴度测定前1天接种HeLa细胞，12孔板中细胞密度为2×105个细胞/孔，含10% FBS的DMEM为1ml/孔，第2天将500µl病毒液及含10% FBS的DMEM 500µl加入到1.5ml的离心管中混匀，并将其加入到预先种好的细胞中，37℃、5%CO2培养箱培养，48h后用流式细胞仪检测阳性率。
慢病毒包装实验流程、原理与步骤
慢病毒包装实验流程、原理与步骤慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。
它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。
其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。
目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。
与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。
慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。
在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
慢病毒包装实验流程如下：1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因；2.根据客户要求选择对应载体；3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体；4. 测序鉴定重组质粒，高纯化（不含内毒素）提取的重组质粒；5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞，进行病毒包装并收集上清液；6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；7. 使用病毒液感染 293T 细胞，药物筛选细胞，构建稳定表达细胞系。
慢病毒使用安全及注意事项1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。
如果使用超净台请不要打开风机。
2.慢病毒感染实验时，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。
3.操作病毒时尽量避免气雾或者飞溅。
如果溅出，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用Parafilm膜封口后离心。
5.废弃的含有病毒的培养基或者病毒接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液（1:20），浸泡一天后丢弃。
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. 0.45μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。
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一、包装细胞293T细胞的培养欧阳光明（2021.03.07）一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达到100%。
慢病毒的包装1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。
2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。
3. 第二天，镜下检查细胞。
细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。
4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml 的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。
另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。
将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。
来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。
每一皿细胞培养盘不要超过6盘。
8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。
9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。
如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。
在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。
12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13. 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。
如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
1. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；4. 4度放置过夜；5. 4度，4000 g，离心 20min；6. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl 和50μl的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio，终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。
每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。
用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。
基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。
震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。
震荡后放在冰上。
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。
从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G 各行的孔中。
分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。