利用EBV转化人类外周血B淋巴细胞获得永生化细胞株
Fc受体——精选推荐
Fc受体Ig根据其重链抗原性的差异分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五类，各类Ig的不同功能主要与其结构有关。
机体内许多细胞表⾯具有不同类Ig Fc的受体，通过Fc受体与Ig Fc的结合，参与Ig介导的⽣理功能或病理损伤过程。
⽬前已鉴定明确属于CD抗原的Fc受体有Fc γR、FcαR、FcεR。
（⼀）FcγR（CD64、CD32、CD16）1.FcγR的结构和分布FcγR可分为FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ三类，它们的结构和分布有所不同。
（1）FcγRⅠ（CD64）：70kDa穿膜糖蛋⽩，属Ig超家族成员，胞膜外区有3个C2结构，基因染⾊体定位于1q23～24。
识别CD64的代表性McAb有McAb22、McAb32.2、197和10.1等FcγRⅠ是⾼亲合⼒受体，Kd值为10-8～10-9M，主要与⼈的单体IgG1、IgG3以及⼩⿏IgG2a和IgG3结合。
与⼈IgG4结合的亲合⼒明确降低，与IgG2则⽆结合能⼒。
FcγRⅠ主要分布于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，但表达⽔平各不相同。
FcγRⅠ位点数：15000～40000/每个单核细胞，>50000/巨噬细胞，<1000/新鲜中性粒细胞。
IFN-γ可刺激单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表达FcγRⅠ⽔平增加5～10倍，G-CSF也有这种促进作⽤。
（2）FcγRⅡ（CD32）：40kDa穿膜糖蛋⽩，属于Ig超家族成员，胞膜外区有2个C2结构，基因染⾊体定位于1q23～24。
识别CD32的代表性McAb有CIkM5、IV·3、KuFc79和41H16等。
FcγRⅡ与单体⼈IgG1，IgG3、IgG4结合为低亲合⼒，Kd5×10-7M。
FcγR Ⅱ表达于除红细胞外的其它⾎细胞，分⼦数⽬：20000～40000/每个细胞。
根据DNA序列和功能不同，FcγRⅡ可分为三种形式，不同形式FcγRⅡ的差别主要在于胞浆区的结构不同。
EBV_对宿主免疫的调控作用研究进展
生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 5 期 681 ~ 689Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述ReviewsEBV 对宿主免疫的调控作用研究进展张旭娟 ， 赵鹏翔* ， 刘子怡 ， 蔡子松 ， 刘梦昱 ， 谢飞 ， 马雪梅北京工业大学环境与生命学部，北京 100124摘 要：EB 病毒（epstein -barr virus ，EBV ）在人群中的感染率高达90%，其能够通过对宿主的免疫调控作用在人体内建立长期感染。
众多肿瘤的发生及发展与EBV 对宿主免疫的调控密切相关，但目前关于EBV 的免疫调控作用机制尚未完全阐明。
EBV 在不同的感染状态下均发展出了一系列对宿主的免疫调控策略，即主要通过靶向Toll 样受体(Toll like receptors ， TLRs)信号通路，利用或限制部分免疫效应以促进长期感染的建立和逃避宿主免疫监控，从而维持EBV 基因组的稳定存在。
概述了EBV 在潜伏期和裂解期与宿主之间的相互作用，探讨了EBV 逃避宿主免疫的策略，旨在为病毒感染防治和病毒相关肿瘤的治疗提供基础理论依据及研究思路。
关键词：EB 病毒；Toll 样受体；免疫调控；核因子κB DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2023.0048中图分类号：Q939.91, R373 文献标志码：AResearch Progress on the Immune Regulation of EBV on the HostZHANG Xujuan ， ZHAO Pengxiang * ， LIU Ziyi ， CAI Zisong ， LIU Mengyu ， XIE Fei ， MA XuemeiFaculty of Environment and Life ， Beijing University of Technology ， Beijing 100124， ChinaAbstract ：As a virus with a human infection rate of up to 90%， EBV can establish long -term infection in the human body through the immune regulation of the host. The occurrence and development of many tumors are closely related to the regulation of host immunity by EBV ， but the mechanism of immune regulation by EBV has not been fully elucidated. EBV has developed a series of strategies for host immune regulation in different infection states ， mainly by targeting Toll like receptors （TLRs ） signaling pathways ， using or limiting part of their immune effects to promote the establishment of long -term infection and evade host immune surveillance to maintain the stability of the EBV genome. This article reviewed the immunoregulatory mechanism of EBV ， a double -stranded DNA herpesvirus ， in order to provide basic theoretical basis and research ideas for the prevention and treatment of virus infection and virus -associated tumors.Key words ：epstein -barr virus ； Toll like receptors ； immune regulation ； NF -κBEBV 又名人类γ疱疹病毒Ⅳ型（human gammaherpesvirus Ⅳ），在全球范围内的感染率超过90%［1］。
如何构建永生化细胞？
研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。
有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。
然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。
通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。
研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究肿瘤发生机制的重要模型。
另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。
研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：1病毒基因转染很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。
这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。
EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。
EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。
目前，EB 病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。
SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。
应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
EB病毒感染的核酸检测:标本类型的选择
EB病毒感染的核酸检测：标本类型的选择郭建巍【摘要】近年来的研究表明,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染与多种疾病的发生有密切的关系.由于EB病毒独特的感染方式,其实验室诊断特别是核酸检测显得尤为重要.本文就EB病毒的生物学特性、感染方式、抗体产生,特别是核酸检测中标本类型的选择、标准化以及未来的检测方向等问题进行了述评和展望,以期为EB病毒感染相关疾病的诊断和预后评判提供更准确的核酸检测结果.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2016(008)003【总页数】5页(P145-149)【关键词】EB病毒;标本;血浆;外周血单个核细胞【作者】郭建巍【作者单位】海军总医院检验科,北京100048【正文语种】中文★通讯作者：郭建巍，E-mail：**************EB病毒（epstein-barr virus，EBV）即人类疱疹病毒Ⅳ型（human herpesvirus type 4），是一种常见的人类疱疹病毒。
EBV初次感染后就终生定居在B细胞中。
据文献报道，约90%以上的成人EB病毒血清学反应阳性，提示在儿童或青少年时感染过EB病毒［1］。
近年来大量研究证明，EBV与人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK细胞淋巴瘤（T/Natural killer cell lymphoma）、Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤发生、发展相关，还与免疫抑制剂使用患者和多种免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴细胞增殖性异常（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）、移植后平滑肌肿瘤、获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）相关性淋巴瘤、多发性硬化、原发性中枢神经系统淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相关［2-7］。
基因工程抗体及其发展前景
基因抗体：通过基因工程手段， 基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要 与抗原结合的CDR功能区 而形成的各种功能抗体． 功能区, 与抗原结合的 功能区 而形成的各种功能抗体．
Complementary-determining regions: CDR
基因工程抗体的分类
基因工程抗体的分类
第二节： 第二节： 基因工程抗体制备的主要方法：
1.人鼠嵌合抗体 人鼠嵌合抗体 （Chimeric Antibodies） ）
• 原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的 重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定 区的进行重组，减少鼠源结构，增加人 源结构，而保持抗体与原抗原的特异性 结合。 • 缺点：
鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反 复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS 反应，human against mouse syndrome)。 嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降 低，但亲和力明显下降。
全人抗体
Fully Human
100% human protein High
Potential for Immunogenicity
Low
Lonberg N. Nat Biotechnol. 2005;23:1117-1125. Ternant D, et al. Expert Opin Biol Ther. 2005;5(Suppl 1):S37-S47. . Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23. Weiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9.
马血清,破伤风,狂犬病
基因工程抗体
鼠源抗体的人源化 及形式多样的改造抗体
第三十章疱疹病毒
第三十章疱疹病毒一、名词解释1．潜伏感染2．整合感染3．巨细胞病毒4．人类疱疹病毒6型5．EV 6．异嗜性抗体7．VCA—IgA抗体8．永生化二、填空题1．常见的人类疱疹病毒包括──、──、──、──等。
2．疱疹病毒中最常引起胎儿先天性感染的是──病毒；与鼻咽癌有关的病毒──病毒。
3．可潜伏在三叉神经节的病毒是──，潜伏在骶神经节的病毒是──。
4．通过垂直传播引起胎儿畸形的疱疹病毒是──和──。
5．病毒感染细胞后可表现为──感染、──感染、──和──感染。
6．疱疹病毒的核酸类型是──，衣壳呈──，──包膜。
7．与宫颈癌关系密切的病毒有──、──和──。
8．HSV的传播途径主要有──、──和──。
9．HSV的原发感染类型主要是──感染，VZV的原发感染类型主要是──感染。
10．带状疱疹只发生于幼年得过──的成人，发病的主要原因──下降。
11．巨细胞病毒除通过垂直传播外，还可以通过──、──和──途径传播。
12．EBV的传播主要是通过──方式，也可以通过──途径感染。
13．HHV一6型的原发感染引起──，还可与──共同感染CD4+细胞。
14．EB病毒与──癌关系密切。
若孕妇血清中检出巨细胞病毒IgM类抗体，提示胎儿有──。
15．HSV—I潜伏于──和──神经节中，HSV一Ⅱ潜伏于──中。
HSV一Ⅱ感染与癌的发生有密切关系。
16．儿童期初次感染水痘一带状疱疹病毒，表现为──；成人复发者表现为──。
17．与EB病毒感染有关的疾病主要有──、──、──。
18．CMV的感染途径有──、──、──、──、──。
19．可感染免疫抑制状态下B细胞的病毒为──。
三、最佳选择题1．可导致胎儿先天性畸形的一组病毒是( )A．柯萨奇病毒、流感病毒、腮腺炎病毒B．风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒C．HIV、乙型脑炎病毒、丙型肝炎病毒D．巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒E．EB病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒2．疱疹病毒不包括( )A．HSV B．VZV C．CMV D．HBV E．EBV3．不符合单纯疱疹病毒特点的一项是( )A．患者和健康者为传染源B．主要经飞沫传染C．原发感染后可形成潜伏感染D．婴幼儿感染HSV—I绝大部分无临床表现E．HSV一Ⅱ与宫颈癌有密切关系4．对疱疹病毒的错误叙述是( )A．均为双股DNA有包膜病毒B．主要通过接触传播C．免疫力低下者在原发感染后形成潜伏感染D．婴幼儿感染多为隐性感染E．病毒基因与宿主基因的整合与致癌关系密切5．下列病毒中可引起潜伏感染的是( )A．麻疹病毒B．疱疹病毒C．风疹病毒D．乙型脑炎病毒E．乙型肝炎病毒6．HSV—I在体内的潜伏部位是( )A．疱疹复发部位神经末梢B．疱疹复发部位淋巴结C．口腔粘膜毛细血管内皮细胞D．三叉神经节E．骶神经节7．带状疱疹的病原是( )A．HSV—I B．HHV一6 C．CMV D．HSV一ⅡE．VZV8．与鼻咽癌有关的病毒是( )A．鼻病毒B．EB病毒C．人类嗜T细胞病毒D．人乳头瘤病毒E．巨细胞病毒9．疱疹病毒潜伏感染的特性是( )A．大多由显性感染转变而来B．大多由dsRNA病毒引起C．体内始终能检出病毒颗粒D．病毒基因通过逆转录方式与宿主基因整合E．妊娠可激活潜伏感染并危及胎儿10．核酸类型为RNA的病毒是( )A．EB病毒B．巨细胞病毒C．单纯疱疹病毒D．风疹病毒E．腺病毒11．传染性单核细胞增多症的病原是( )A．EB病毒B．巨细胞病毒C．单纯疱疹病毒一2型D．单纯疱疹病毒-l型E．水痘带状疱疹病毒12．巨细胞病毒引起的疾病不包括( )A．肝炎B．先天性畸形C．间质性肺炎D．输血后单核细胞增多症E．口唇疱疹13．通过输血传播的疱疹病毒有( )A．EBV、VZV B．HSV、EBV C．CMV、EBV D．VZV、HSV E．HSV、CMV14．通过性接触传播的疱疹病毒有( )A．EBV、HSV B．CMV、EBV C．VZV、HSV D．HSV、CMV E．VZV、EBV15．HSV—I的原发感染多引起( )A．成人生殖器疱疹B．儿童口唇疱疹C．6个月以上婴幼儿隐性感染D．传染性单核细胞增多症E．疱疹性脑炎16．HSV一Ⅱ的潜伏部位是( )A．三叉神经节B．迷走神经节C．颈上神经节D．骶神经节E．B淋巴细胞17．正B病毒的潜伏部位是( )A．T淋巴细胞B．B淋巴细胞C．嗜中性粒细胞D．骶神经节E．三叉神经节18．下列哪项不是巨细胞病毒感染的快速诊断方法( )A．细胞培养分离病毒B．尿沉渣细胞镜检观察巨细胞及核内嗜酸性包涵体C．PCR技术检测标本中的CMV基因D．荧光抗体检测标本中的CMV抗原E．ELISA检测患者体内CMV特异性IeM19．最常引起胎儿先天性畸形的病毒是( )A．HIV B．HBV C．CMV D．HSV—I E．HSV一Ⅱ20．下列哪项不是可以在人二培体细胞中培养的疱疹病毒( )A．HSV—I B．HSV一ⅡC．CMV D．EBV E．VZV21．疱疹病毒增殖性感染的激活原因主要有( )A．妊娠B．其它微生物感染C．情绪紧张D．应用免疫抑制剂E．病毒变异22．下列哪项不是疱疹病毒引起的感染类型( )A．迟发感染B．隐性感染C．整合感染D．潜伏感染E．先天感染23．巨细胞病毒的潜伏部位不包括( )A．乳腺B．肾脏C．涎腺D．白细胞E．红细胞24．不引起小儿皮疹的病毒为( )A．风疹病毒B．麻疹病毒C．HHV一6 D．HHV一7 E．HHV一825．无EB病毒受体的细胞为( )A．B细胞B．T细胞C．腮腺管上皮细胞D．咽部上皮细胞E．宫颈外上皮细胞26．对于应用无环鸟苷治疗有效的病毒为( )A．HSV B．HBV C．EBV D．HFRSV E．CMV27．体外培养能形成巨大细胞和猫头鹰眼状嗜酸包涵体的是( )A．CMV B．HSV C．VZV D．EBV E．HBV28．与卡波济肉瘤有关的病毒为：( )A．EBV B．HHV6 C．HHV8 D．HHV7 E．HSV四、问答题1．简述疱疹病毒的生物学特性和致病特点。
EB病毒转化外周血B淋巴细胞建永生细胞系的四种方法探讨
[2]黄小义，刘岸，于呖，等.中国 10 个民族永生细胞系的建立与
保存[J]援遗传 HERED~ AS(Beijing)，2002(24)：643-645.
[3]N eitzel H 援A r o utine m ethod for the establishm ent of
permanent growing lym phoblastoid cell lines援 H um Genet，
特定的疾病基因组资料成为可能。
EB 病毒是一种高效率的转化病毒，它的靶细胞仅限于人类
的 B 淋巴细胞，对其它类型的细胞没有感染的危险性[4]。利用
EB 病毒转化人类外周血细胞使成为具有永生化特性的 LCL 用
保存人类全基因组完全可以的。本文进一步证实，微量全血法
和全血冻存法适合于短时间内采集大样本量采集、储存然后逐
荡，以避免溶血。
保存备用。CyA 液:，环孢霉素 A (Cyclosporine A ，CyA )购自北
1.2 材料
京索菜宝科技有限公司，用无血清培养基稀释成 0.2mg/ml，使用
R PM I-1640 (Biosharp 北京),淋巴细胞分离液购自天津市 时最终浓度为 2ug/ml。
灏洋生物制品科技有限责任公司，环孢霉素 A (Cyclosporine A
冻存全血法：取抗凝全血 0.5ml,加入 1ml 细胞冻存液，混合
器、水平式离心机、超纯水仪、电子天平、恒温水浴箱、普通冰 后置低温冰箱（-40℃），2 天之后移至液氮中。细胞冻存一周以
箱、超低温冰箱、液氮保存罐和转运罐。
上后 分批 在 37℃ 水 浴 快 速 复 苏，转 入 T-25 培 养 瓶 中，8ml
1.5.3 外周血淋巴细胞的分离：取 3-5ml 肝素抗凝血，加倍
EBNA2 基因在淋巴母细胞中的表达
EBNA2 基因在淋巴母细胞中的表达发表时间：2020-04-07T16:39:56.303Z 来源：《医师在线》2020年3期作者：路素丽[导读] 通过检测EBNA2在EBV转化的淋巴母细胞的表达分析，[摘要] 目的：通过检测EBNA2在EBV转化的淋巴母细胞的表达分析，为研究EBV相关淋巴瘤的发生发展提供相应科研数据。
方法：采用免疫组织化学法检测EBNA2基因在EBV转化淋巴母细胞的细胞蜡块和正常人淋巴细胞的细胞蜡块中的阳性结果。
结果：EBNA-2在转化淋巴母细胞的细胞蜡块中呈现棕褐色颗粒的阳性表达，而在正常淋巴细胞细胞蜡块中不表达。
结论：EBNA2在EBV转化的永生化淋巴细胞的细胞蜡块中表达，我们推断EBNA2在EB病毒相关恶性淋巴瘤的形成过程中可能起了某些促进作用。
关键词：EB病毒（EBV）；EB病毒核抗原-2（EBNA2）；淋巴瘤EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是一种嗜人类淋巴细胞的双链γ-DNA疱疹病毒[1]，研究发现大部分的成年人均感染过EB病毒，多表现为B淋巴细胞终身携带无症状感染。
EB病毒潜伏感染状态通常表达为三个潜伏膜蛋白和六个核蛋白[2]，其中EBNA-2是EB病毒在感染宿主细胞后最早表达的病毒基因产物之一，本实验在体外培养建立EBV转化的淋巴细胞，采用免疫组织化学技术检测EBNA2在EB病毒转化淋巴母细胞的细胞蜡块和正常淋巴细胞以中的阳性表达情况，来推测和研究分析EBNA2在EB病毒相关淋巴瘤中的作用以及影响。
1.材料与方法1. 1 获取转化淋巴细胞采取饥饿法将B95-8细胞放置7天至9天，然后收集培养液，1000转/分钟速度离心后弃掉上清，从而得到EB病毒的悬浮液。
再进行分离全血淋巴细胞，取EB病毒重悬淋巴细胞，在培养箱培育。
获得细胞聚集成团生长的EB病毒转化淋巴母细胞，镜下观察转化的淋巴母细胞体积比正常淋巴细胞体积明显增大[2]。
1. 2 免疫组织化学技术检测EBNA2的阳性表达情况收集大量培养的细胞，转移至离心管，以2000/分钟的离心速度离心5-6分钟，并且重复离心三次。
EB病毒相关淋巴母细胞样细胞系的建立及鉴定
瘤性 的相关研究提供基 础 。 方 法
表面标记 以及核 型的鉴定 。 结果
利用体外培 养 Ｂ ５ 细胞产 生 Ｅ ９． ８ Ｂ病毒原型 株感染正 常人 外周血淋 巴
ａ ｄｉ ｉ ｏ Ｍｅ ｈ ｄ Ｎｏｍａ ｅｉｈ ｒ ｌ ｌｏ ｍｐ ｏ ｙｅ ｒ ａ ｓｏｍ ｅ ｔ ｎ ｖｔ ． ｎ ｒ ｔｏ ｓ ｒ ｌ ｒ ｅａ ｏ ｄｌ ｐ ｐ ｂ ｙ ｈ ｃ ｔｓｗｅｅｔ ｎ ｆｒ ｄｗｉ ＥＢＶ ｒ ｔｔｐ ｒ ｄ ｃ ｄ ｒ ｈ ｐ ｏｏ ｅｐｏ ｕ ｅ ｙ
淋 巴母 细胞 样细胞 系能不断传代 ， 能表达 Ｅ Ｖ基 因 ， Ｂ 具有成 熟 Ｂ细胞
细胞培养传代 得到 ５ Ｅ 株 Ｂ病 毒相关淋 巴母 细胞 ， 并用 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ对 其进行 了基 因表达 、 流式细胞仪 进行细胞
表面 标记 ； 细胞 传 代过 程 早期 未 发 生 核 型改 变 。 结论
ＬＣＬ — Ｌ ２ ５、 ＣＬ３ ５、 — ＬＣＬ — ０、 ４ ３ ＬＣＬ５ ３ 。 — ０
建 立 了 ５ 永 生 化 细胞 株 ， 别 为 Ｌ Ｌ１ 、 株 分 Ｃ — ５
【 关键词］ Ｅ Ｂ病毒 ； 生化 ； 永 转化细胞 系 ； 巴细胞 淋
Ｄｅ ｅｏ ｍｅ ｔ ｎ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎｏ ｍｐ ｏ ｌｓｏｄｃ ｌｌ ｅ ｓ ｏ ｉｔｄｗｉ ｐ ｔ ｉ－ ｒ ｖｒ ｓ ｖ ｌｐ ｎ ｄ ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｆｌ ａ ｄ ｉ ｆ ｏ ｙ ｈ ｂａ ｔ ｉ ｅｌｉ ｓａ ｓ ｃａｅ ｔ Ｅ ｓｅｎ Ｂａ ｒ ｉ ｎ ｈ ｕ
ｉ ｍｍｏ ｔｌ ａ ｉｎ ａ ｓ ｃ ａ ｅ ｔ ＢＶ ｅ ａ ｓ ｆｉ ｅ ａｉ ｅ ｙ ｓｍｐ ｅ ｐ ｏ ｅ ｓ ｆ ｒ ｅ ｍｏ ｅ ｓ ｍｅ ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｆＢ ｒ ｉ ｔ ｓ ｏ ｉｔ ｄ ｗｉ Ｅ ａｚ ｏ ｈ ｂ ｃ ｕ ｅｏ ｓｒ ｌ ｔ ｌ ｉ ｌ ｒ ｃ ｓ ， ｕ ｔ ｒ ｒ ｏ ｈ ｒ ｃ ｅ ｓｏ ｔ ｖ ｈ
EBV的信号转导机制
EBV 的信号转导机制——LMP1的信号通路Epstein-Barr 病毒（EBV ）属于ｒ疱疹病毒。
与其它疱疹病毒一样，EBV 通过建立一种潜伏感染的能力在宿主体内持续存在，然后周期性的活化，产生具有感染能力的病毒感染其它宿主。
EBV 导致人疾病综合征可反映出EBV 感染的细胞类型，其中大多数为淋巴细胞或上皮细胞起源。
大多数人会在原发感染后一直携带EB 病毒，并且会形成细胞免疫对抗EBV 的各种裂解和潜伏相关蛋白。
EBV 基因组含有18万个碱基对，并通过其末端重复序列的共价融合形成环状。
整个基因组以游离体的形式存在于细胞内，这些游离体有时也能够整合到细胞的DNA 中。
用EBV 体外感染人类的B 淋巴细胞，使其永生化得到淋巴瘤样细胞株（LCLs ），这些EBV 恶性转化的LCLs 含有EBV 的游离体（Episome)并且表达一系列产物，其中包括六种核蛋白：EBNA-1，EBNA-2，EBNA-3A,EBNA-3B,EBNA-3C,EBNA-LP;三种潜伏感染的膜蛋白：LMP1，LMP2A,LMP2B 以及两种RNA （EBERs)。
三种潜伏膜蛋白是在与EB 病毒感染有关的许多疾病中表达的功能蛋白，它们都没有受体的跨膜信号蛋白。
EBV 在潜伏感染状态下表达的蛋白可能是B 淋巴细胞生长转化的介质，因此其得到广泛细致的研究。
其中的LMP1由于其被明确证明能转化原代B 细胞。
在不同的细胞类型中，LMB1具有多种信号转导和广泛的基因调控作用，LMP1也正是通过这些信号通路和基因调控发挥广泛的生物学功能，包括上调B 细胞标志及细胞粘附分子CD23、CD40、CD45等的表达。
LMP1也能激活细胞粘附分子LFA1、LFA3和ICAM1等的表达，还能通过诱导抗凋亡基因A20和Bcl-2的表达抑制细胞凋亡。
因此，LMP1的功能涉及到细胞转化、增值、细胞凋亡和分化的各个方面。
图 LMP1的信号传导通路图 P AFT2 AFT2 P ELK1 ELK1 JNK SEK + NF-KB p I ҡB p NF-KB I ҡB NF-KB I ҡB TRAF3 TRAF2 TRAF1 CTAR2 TRADDCTAR1 ELK SRE SDE JAK3 STA T3 ICAM C-Fos C-Jun/AFT2C-Jun-AP-1 AP-11 LMP1的分子结构及其转录调控LMP1是由EBV基因组右端的BNLF-1基因编码的跨膜蛋白，其分子量因EBV株的变异介于60~66kDa之间。
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利用EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞获得永生化细胞株保存人类全基因组摘要：人类外周血B 淋巴细胞可以被Ebv 在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的LCL 。
保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化。
环孢霉素A 法是建立珍贵样本的LCL 的首选方法。
采血12到36小时分离转化B 淋巴细胞，转化液中添加cysA 、pha ，控制转化时细胞数量在106/ml 数量级有助于提高建株率。
37℃5%二氧化碳恒温培养，及时添加新鲜的RPMI 1648培养液以及全程无菌操作防止细菌真菌污染至关重要。
慢冻迅速升温是冻存、复苏的关键。
原代和继代之间G 条带分析、核型对比、对常见变异位点应用PCR 进行质控有助于发现LCL 的细胞变异。
关键词：EBV 转化 B 淋巴细胞 LCL人类外周血B 淋巴细胞可以被EB 病毒（Epstin-Barr Virus,EBV ）在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的人类淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell lines,LCL ）。
该细胞株保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化]2,1[。
因此，利用EBV 建立具有人类全基因组的永生化细胞株，成为保全全世界各民族特有种群基因及研究人类缺陷基因疾病乃至人类长寿基因探讨的首选方法。
近十年来，我国使用这种方法建成了十多个少数民族]6543[、、、以及基因缺陷疾病]131********[、、、、、、、免疫抗体技术]1514[、甚至长寿人群家系]16[的LCL ，其应范围也已经突破医学延伸至体育领域]17[。
事实证明，建立能永久保存的细胞系是打破传统研究中研究的接力式进行与样本的暂时性存在矛盾的关键所在]16[。
1 EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞建立LCL 的机制及病毒来源EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞的机制尚未完全明晰，可能与p53抑癌基因依赖的正常细胞调控机制被抑制以及端粒酶活性增强有关]18[。
p53是通过阻滞正常细胞由G1/G0期进入S 期来诱导细胞凋亡的。
尽管EBV 转化的LCL 细胞内p53水平增高，但由其介导的细胞凋亡事件能被EBV 本身的潜伏蛋白和EBV 诱导的细胞蛋白所中断，从而使LCL 获得了无限增值的能力。
同时，EBV 转化的LCL 端粒酶活性显著提高，维持了正常人体细胞端粒的长度，使LCL 逃逸了细胞的M1、M2期获得了永生化。
由EBV 转化获得LCL 的过程是一种可逆转的现象，这就相当于赋予了LCL 永生化特性的同时又没有赋予其复杂的肿瘤背景，从而令LCL 成为深入研究细胞永生化机制的良好模型。
EBV 是一种已知序列的病毒，其插入人类基因中时主要以完整插入为主，这种特性可以被我们加以利用，方便在以后的研究中剔除相关影响。
EBV 可以利用细胞培养的方法大量获得。
市售的B95-8细胞具有永生化特征，使用RPMI 1640培养基、37℃、5%CO2条件即可在体外大量增殖。
B95-8细胞经饥饿裂解之后，通过离心、过滤后获得的培养上清液富含EBV ，具有可使人类外周血B 淋巴细胞转化为永生化细胞的能力，该上清液还可以分装、冻存，方便实验员使用。
我国现有的EBV 主要有三个来源，即上海生物制品所（上生所）、昆明动物研究所（昆明动物所）和中科院人类发育与遗传研究所（中科院遗传所）。
笔者曾于2001至2003年间使用中科院遗传所馈赠的EBV ，运用EBV 转化加环孢霉素A 的方法建立涵盖百岁老人至其66岁以下直系亲属共65株永生化细胞株，并在随后的几年间陆续建立起累计超过140株永生化细胞株且全部经冻存、复苏验证成活。
2 使用EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞建立LCL 细胞株的方法使用EBV 转化人类外周血B 淋巴细胞建立LCL 细胞株的过程大致分为五个步骤，即分离B 淋巴细胞、EBV 转化、LCL 细胞培养、LCL 细胞验证冻存和LCL 细胞复苏培养及再冻存。
当前比较成熟的利用EBV 转化人外周血B 淋巴细胞建立永生化细胞株的方法有三种。
分别是环孢霉素A 法、微量全血法及冻存全血法。
环孢霉素A 法通常在培养液中加入终浓度为2ug/ml 的环孢霉素A （CysA ）及终浓度为0.5% 的植物血球凝集素（pha ），且需要分离B 淋巴细胞并将其细胞数量调整到106个/ml 级别才能转化，虽然操作较复杂，但一次性建株成功率高。
微量血细胞法不必分离B 淋巴细胞，不添加CysA 及pha ，直接使用0.1ml 抗凝全血进行转化。
冻存血法的实质是微量全血法，仅仅是在转化前处理样本时将抗凝全血与适量的抗冻剂二甲基亚砜（DMSO ）混匀分装成小支冻存，以便在首次转化失败后的两年内能再次复苏样本进行多次转化以达到提高建株成功率之目的。
有文献报道，微量全血法和冻存全血法建立LCL 的成功率分别为46%及85%]19[。
笔者采用环孢霉素A 法三次建立LCL 时成功率分别为66.6%(24/36)、96.4%(53/55)和64.7%(66/102)，与相关文献的建株成功率相符]2120[、。
建议：对于珍贵不可第二次获得的样本的处理首选环孢霉素A 法；微量全血法主要应用在大样本来源时；对于采血数量比较丰富的样本可酌情使用冻存全血法。
笔者在转化LCL 过程中使用的各种试剂配方如下：RPMI 1640基础培养基的配制：在灭菌烧杯中加入大约1500ml 灭菌三蒸水，随后分别加入RPMI 1640一袋，100U/L 青霉素和100U/L 链霉素，4gNaHCO3、10ml 0.5%的pha[植物血球凝集素]、32ml 1M Hepes 液、24ml 0.2M 谷安酰胺溶液。
充分溶解后，移至灭菌过的2000ml 容量瓶，期间使用100ml 左右三蒸水洗涤两次烧杯并将洗涤液一并加到容量瓶中。
最后用灭菌三蒸水定溶至2000ml 。
20%胎牛血清培养基：（100ml ）使用20ml 胎牛血清及80ml RPMI 1640基础培养基混匀即可。
冻存液：（100ml ）使用5ml 二甲基亚枫(dimethyl sufoxide)及95ml 20%胎牛血清培养基混匀即可。
随配随用。
2~8℃冰箱保存。
使用时应尽量将温度控制在8℃以下。
3 讨论1 全血使用肝素抗凝，应用液浓度5u/ml ，可抗凝5-10ml 外周血。
采血之后宜在12到36小时转化。
太早，血液中的免疫因子活性太高，可能导致转染率下降。
太迟，B 淋巴细胞活性可能受到影响，导致细胞凋亡增多、转染率下降。
2 淋巴细胞分离液应避光4度保存，用前在37度水浴中保温。
整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。
3 分离B 淋巴细胞时，先取3ml 肝素抗凝全血与3ml RPMI 1640培养基等量混匀再沿离心管壁缓缓加入4ml 淋巴细胞分离液，分离时离心机的转速控制在2500~3500转/分钟之间，时间为10分钟。
而在洗涤分离出来的B 淋巴细胞时，离心机转速应降低至1500转/分钟，时间延长为15分钟，既保证B 淋巴细胞充分集中在离心管底部又不至于因离心力过大导致破碎。
洗涤两次即可。
4 EBV 液储存于零下80度。
使用时从深低温冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um 的滤膜过滤，融化后的EBV 在30到60分钟内用完以防活力失效。
5当B 淋巴细胞分离不够纯的时候，掺杂的其他细胞也将在培养瓶中存活一段时间，这不仅仅会消耗培养瓶中的养分，甚至会因为掺杂细胞凋亡破碎，导致培养瓶中液体变浑浊，从而影响LCL的生长以及我们的观察；当分离出的B淋巴细胞的数量太少时，转化成功后的细胞浓度太低，同样不利于LCL的增值分裂。
因此，将转化瓶中B淋巴细胞维持在1~10×106/ml级别中相当有必有。
6环孢霉素A能在细胞周期G0G1期之间选择性抑制分离不清的T淋巴细胞的RNA聚合酶Ⅱ，能有效阻止T淋巴细胞对EBV的免疫应答，防止LCL 受T淋巴细胞的攻击]22[，从而大大提高建株成功率，因此适用于珍贵样本的转化。
但由于其操作较复杂，不建议一个人一次操作数量大于50个样本。
7 EBV转化人类外周血B淋巴细胞成功的标志是：细胞变亮、变大、变圆，培养瓶中出现分裂成团的细胞。
在转化的前三天，我们也可以观察到上述现象。
这是由于转化液中混杂的T淋巴细胞正在增生所致。
这种细胞基本会在持续培养两、三周以内凋亡。
转化所需时间因对象的不同情况差别较大，通常在接种后4~7天左右可以观察到转化细胞。
笔者在转化高龄人群外周血B淋巴细胞时通常需要7~10天才可以观察到细胞变化，最长时曾碰到转化21天后才出现细胞变化的情况。
这可能与老年人细胞临近末次分裂周期和/或EBV感染背景不同所致。
笔者建议，如果在首次转化后15天还没有观察到细胞变化，可对细胞进行二次转化。
如二次转化仍不成功只能启用事先冻存的全血进行补救，或重新采样。
8 悬浮细胞的培养过程防细菌和真菌的污染。
配制培养时可以加入终浓度为100U/L的青霉素和链霉素以防细菌生长。
培养箱在使用前应该彻底消毒。
每次操作前要对操作间进行紫外线照射。
尽量使用生物安全柜操作。
胎牛血清的使用必须先灭活，然后随时过滤随时使用。
暂存培养基的冰箱也要保持干净、有序。
各种操作器械最好使用一次性的无菌器械。
严格的无菌操作观念是转化成功后能否完成建株的关键。
9 培养时采用37℃恒温5%二氧化碳培养箱。
培养瓶的瓶盖最好采用带滤纸的有孔培养瓶。
如无此瓶，务必稍微拧松瓶盖保持必要的通气。
瓶中培养液必须含有Hepes液，以便维持培养瓶中的pH值。
10 对培养瓶中细胞生长不佳，细胞凋亡严重，培养液混浊，甚至生长细胞团中央出现黑色斑块的细胞应及时采用无菌操作取出培养细胞，重新调整细胞浓度后予在新的细胞瓶中继续培养，以期尽量挽救LCL。
11 当培养瓶中的培养液变黄时，提示瓶中细胞生长旺盛，养分消耗增多，培养液变酸，此时应及时添加新鲜的RPMI 1640；当瓶中细胞呈指数式增长时，应及时将细胞团打散，必要时做分瓶处理，以保持适当的细胞密度；当细胞数量达到冻存要求时，应及时收集指数式生长期的生长活跃细胞进行玻璃化冻存。
12 培养液采用含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，配制培养基的水质、各种成分的添加必须准确，并经过验证。
13植物血球凝集素（pha）是人类血淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在pha作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴细胞，进而进行有丝分裂。
在培养液中添加pha可以促进LCL的生长，但不能令B淋巴细胞转化为LCL。
14 冻存和复苏。
推荐使用玻璃化冻存方法。
将处于细胞培养指数期生长的无污染细胞于1000转/分钟离心收集0.5ml沉淀细胞，轻轻吹打混匀后加入到含有1.5ml冻存液的冻存管，盖盖、封口、标记、打包，放置到1cm厚壁的泡沫盒于-20度冰箱保存2小时，随后转到-70度冰箱过夜，最后投入到液氮罐中。