代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
药物代谢稳定性筛选的研究进展 翁 骏综述 吕秋军
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Foreign Medical Sciences Section of Pharmacy 2006 Jun；33（3）
化不良，曾采用各 种 方 法 寻 找 它 的 替 代 品：（1）原 代 肝细胞的永生化；（2）控制培养条件选出特定功 能 的 肝细胞系；（3）转分化人类前体细胞如骨髓间质 造 血 干细胞成为肝 细 胞。 迄 今，还 没 有 找 到 一 个 稳 定 的 细胞系能像原代肝细胞那样同时具有代谢转运和酶 诱导等分化功能。
CYP 的催化作用依赖于还原 型辅酶Ⅱ（NADPH）、 NADPH-P450 还 原 酶、细 胞 色 素 b5 和 氧 分 子。因 此， 测量代谢反应中氧或 NADPH 的消耗可以反映化合物 的代谢速度，而不用测定原形化合物的消失量。检 测 方法包 括：（1）基 于 NADPH 消 耗 的 检 测 法，NADPH 是 CYP 介导的氧化代谢反 应 中 重 要 的 辅 因 子，电 子 从 NADPH 传 递 至 CYP 酶，随 后 活 泼 氧 中 的 两 个 氧 原子其中 一 个 插 入 底 物，另 一 个 形 成 水，在 此 过 程 中，NADPH 的消耗量可反映底 物 的 代 谢 量；（2）基 于 氧 消 耗 的 检 测 法 ，采 用 这 种 方 法 基 于 一 个 前 提 ，即 认 为在 CYP 参与的代谢反应 中，氧 分 子 的 消 耗 量 应 与 底 物 的 代 谢 量 成 正 比 ；（3）基 于 过 氧 化 氢 消 耗 的 检 测 法，过氧化氢和过氧酸等 氧 化 剂 在 CYP 催 化 的 反 应 中可以代替氧气 和 一 个 电 子 供 体，被 称 作 过 氧 化 物 旁路，特定过氧化 物 的 消 耗 量 可 在 一 定 程 度 上 反 映 底物 的 消 耗 量；（4）基 于 活 性 氧 簇（ reactive oxygen species，ROS）生成的检测法，在代谢 反应 过程中 CYP 不仅 催 化 底 物 的 氧 化，还 参 与 生 成 ROS，如 超 氧 化 物、过氧 化 氢 和 氢 氧 根。 采 用 此 种 方 法 的 前 提 是： （1）大多 数 CYP 介 导 的 氧 化 反 应 中，底 物 的 转 化 和 ROS 的生成呈正比关系；（2）ROS 可使无荧 光前 体转 化为荧光产物用于检测，该 反 应 的 速 度 与 ROS 的 生 成和底物的消 耗 成 正 比。 值 得 注 意 的 是，虽 然 这 些
代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异同时，肝细胞中存在着多种代谢途径，如CYP、UGT、SULT等，化合物可能同时被多种代谢酶代谢，导致代谢产物的种类和数量较多。
而肝微粒体中仅存在少数几种代谢酶，化合物的代谢产物种类和数量相对较少。
因此，化合物在LMS 和HMS中的代谢产物种类和数量的差异是机制性的原因。
2.2经验性原因除了机制性原因外，LMS和HMS结果存在差异还有一些经验性的原因。
例如，不同制备方法和制备批次的肝微粒体和肝细胞可能存在差异，不同实验室使用的肝微粒体和肝细胞也可能存在差异。
此外，实验条件的不同，如温度、pH值、底物浓度等，也可能导致LMS和HMS结果存在差异。
因此，在进行LMS和HMS实验时，需要注意控制实验条件的一致性，以减少经验性因素对结果的影响。
3 如何选择数据进行化合物评价和预测人体清除率在进行化合物评价和预测人体清除率时，应该选择LMS 和HMS中较慢的代谢速率作为标准值。
因为这个代谢速率反映了化合物在体内的代谢稳定性。
同时，应该注意控制实验条件的一致性，以减少经验性因素对结果的影响。
在预测人体清除率时，可以根据化合物在LMS和HMS中的代谢速率，结合药物的分布和排泄特性，进行体内药物动力学模型的建立和预测。
化合物主要通过非CYP代谢酶如AO、UGT和MAO-A 在肝细胞中代谢，而肝细胞中这类酶的含量高于肝微粒体，因此化合物在肝细胞中的代谢速率较快。
然而，当化合物为肝脏主动摄取转运体时，肝细胞代谢速率并不会快于肝微粒体。
这一点在Mechanistic insights from comparing intrinsic clearance values een XXX一文中得到了证实。
此外，一些经验性的研究表明，LMS与化合物的理化性质、渗透性和酶表型有关。
其中，主要经CYP3A和UGT代谢的化合物其固有清除率LMS高于HMS。
这一点在XXX一文中得到了验证。
面对LMS和HMS的差异，我们需要解决两个问题：在化合物筛选早期，以哪个数据为准来进行化合物的ranking；在化合物开发阶段，采用哪个数据来进行人体清除率的预测。
代谢稳定性及其研究方法
微粒体 稳定性
测定用 缓冲液
血浆 pH缓冲液
体液
药物发现过程中多种稳定性的体外评估
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代谢稳定性
药物代谢反应通常被分为一相反应（phase I）和二相反应（phase II） 一相反应 是对化合物分子结构本身的修饰，如氧化或去烷基，最常见的是 脂肪族和芳香族碳原子的羟基化， 是将极性基团结合到分子结构中。
代谢稳定性的数据的应用
指导结构修饰以提高稳定性 选择最佳化合物进行体内PK或活性测试 前瞻性预测体内PK行为 回顾性诊断体内PK差的根本原因 CYP表型分析：进行体外试验，研究化合物由哪种CYP同工酶代谢
CYP同工酶的底物特征
CYP 3A4 2D6 2C9 1A2 logP范围 0.97~7.54 0.75~5.04 0.89~5.18 0.08~3.61 其他特征 较大分子 碱性分子（离子化） 酸性分子（非离子化） 平面胺或酰胺 代表性底物 硝苯地平 普萘洛尔 萘普生 咖啡因
Biorad 二相代谢
代谢物稳定性
ADMENSA
Inparmatica 肝细胞
代谢物稳定性 ，代谢物结构
500/week
Meteor
代谢物/week
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用于代谢稳定性研究材料
肝组织
匀浆化 过滤，离心（500 g, 10 min） 核，细胞
8
针对一相代谢稳定性的结构修饰
在对结构进行修饰以提高稳定性前，推测代谢特定位点是有必要的，对此研 发人员开发了代谢物结构推测的高通量方法。 一相代谢的结构修饰的关键特征：1）化合物和代谢酶的结合； 2）化合物 分子中特定部位的反应性，这些部位可接近CYP酶的反应性亚铁血红素或其 他酶的活性位点。 减弱这些化合物结合部位的活性都可增加代谢稳定性。但是由于存在代谢切 换，这些策略并不是100%成功。 改善一相代谢稳定性的结构修饰策略： 引入氟、氯、腈基封闭代谢位点：反应活性低于同一位点的氢，氟对分 子大小影响最小。 引入其他基团封闭代谢位点：引入较大的脂肪族取代基 去除易代谢的官能团：去除易去烷基化的基团。 环化：在易代谢位点引入环结构 该变环的大小： 改变手性 降低亲脂性 替换不稳定基团
体外药物肝代谢研究进展
体外药物肝代谢研究进展前言药物代谢是药物学的重要分支领域，其中肝脏是药物代谢的重要器官。
药物在肝脏内发生代谢可以产生活性代谢产物或用于排泄，但也可能产生有害的代谢产物。
因此，研究药物在肝脏内代谢的过程和机制具有重要的理论和应用价值。
目前，研究表明体外模型是研究药物肝代谢的重要方法。
本文将就体外药物肝代谢研究的进展进行综述。
体外药物肝代谢研究方法体外研究药物代谢的方法有很多，其中包括人肝微粒体、肝细胞、肝切片等模型。
人肝微粒体模型人肝微粒体是一种体外研究药物代谢的模型，它由肝细胞中提取出来的包含细胞膜的小颗粒体系。
人肝微粒体可以在一定程度上模拟体内肝脏的药物代谢代谢的过程，其代谢产物也具有一定的生物活性。
但是人肝微粒体只能反映肝脏微粒体内药物代谢情况，不能反映肝脏整体药物代谢情况，因此该模型在肝肾功能障碍、药物相互作用等情况下的可靠性存在一定的限制。
肝细胞模型肝细胞模型是一种常用的体外药物肝代谢研究模型。
肝细胞在肝脏内是药物代谢的主要细胞类型，因此肝细胞模型可以更真实地反映体内药物代谢的情况。
其中包括原代肝细胞、肝癌细胞、人工合成的肝细胞系。
原代肝细胞具有较高的可靠性，但存在数量有限、耗时、稳定性差等问题。
人工合成的肝细胞系可以大量培养并保持稳定，但代谢能力和原代肝细胞存在一定的差异。
肝切片模型肝切片模型通过将肝组织切片后在体外培养来研究药物代谢。
肝切片模型可以更真实地反映药物在肝脏内发生代谢的情况，同时又能维持肝组织的结构和功能。
但是肝切片模型的复杂性和操作难度较大，且易受肝切片的来源、保存条件等影响，因此该模型目前应用较少。
药物肝代谢研究领域的进展药物-药物相互作用的研究许多药物的代谢方式存在重叠，一些药物通过影响其他药物的代谢加速其代谢或延迟其代谢。
目前，体外研究和体内研究相结合的方法是研究药物-药物相互作用的主要途径。
体外实验可以测定药物代谢酶对药物排泄的影响，也可测定药物代谢酶间的相互作用，但它不能完全模拟体内情况。
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体代谢产物鉴定
肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，它参与了多种代谢过程，包括
脂肪酸代谢、胆固醇代谢、药物代谢等。
肝微粒体代谢产物鉴定是一
种通过检测肝微粒体代谢产物来评估肝脏功能的方法。
肝微粒体代谢产物鉴定的原理是利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）检测肝微粒体代谢产物的含量。
这些代谢产物包括脂肪酸代谢产物、胆固醇代谢产物、药物代谢产物等。
通过检测这些
代谢产物的含量，可以评估肝脏功能的状态。
肝微粒体代谢产物鉴定可以用于评估肝脏疾病的严重程度和预后。
例如，在肝炎、肝硬化等疾病中，肝微粒体代谢产物的含量会发生变化。
通过检测这些代谢产物的含量，可以评估肝脏疾病的严重程度和预后，为治疗提供参考。
此外，肝微粒体代谢产物鉴定还可以用于评估药物代谢的差异性。
不
同个体的肝脏代谢能力存在差异，有些人可能会因为代谢能力差异而
出现药物不良反应。
通过检测肝微粒体代谢产物的含量，可以评估药
物代谢的差异性，为个体化用药提供参考。
总之，肝微粒体代谢产物鉴定是一种重要的评估肝脏功能的方法。
通过检测肝微粒体代谢产物的含量，可以评估肝脏疾病的严重程度和预后，评估药物代谢的差异性，为治疗和个体化用药提供参考。
药物体外肝代谢研究方法
药物体外肝代谢研究方法摘要：对近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。
介绍肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流及器官组织切片法。
其中，肝细胞体外温孵法是当今药物体外肝代谢研究的热点，对新药研究与开发及正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用，将对其进行重点论述。
关键词：体外肝代谢；肝微粒体；肝细胞；离体肝灌流；组织切片广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程［1］。
狭义的药物代谢是指药物的生物转化。
生物转化后，药物的理化性质发生变化，从而引起其药理和毒理活性的改变。
因此，研究药物的生物转化，明确其代谢途径［2］，对制定合理的临床用药方案，剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。
当前，国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径。
在分子生物学技术推动下，药物代谢酶［3］领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的推动意义，已得到广泛的重视。
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统［4］，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。
以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。
1 肝微粒体体外温孵法肝微粒体法［5］是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶［6］，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，制备肝微粒体一般用差速离心法。
肝微粒体体外温孵法和其它的体外肝代谢方法相比较，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。
但肝微粒体体外温孵法同其它体外肝代谢方法相比，在体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。
2 肝细胞体外温孵法肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。
氯丙嗪在不同种属肝微粒体中代谢差异研究
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氯丙嗪 !1XI$又 名 冬 眠 灵"是 一 种 吩 噻 嗪 类药物)=*"具有 安 神%镇 定 的 功 效"常 用 来 治 疗 精神类疾病)(*"其在兽医临床上应用广泛"一 方 面 可 以 降 低 动 物 的 死 亡 率"另 一 方 面 可 以 间 接 起到增加动物体质量的作用)"*&氯丙嗪的 过 量 使用容易引起白细胞减少和迟发性运动障碍 等"危害生物 健 康)(*& 氯 丙 嗪 容 易 在 生 物 体 内 代 谢"采 用 体 外 孵 育 肝 微 粒 体 的 方 法 进 行 代 谢 研究"既可模拟药物在体内的代谢过程)!*"又 可 避免体内复杂基质对结果产生影响)**"因 此"研 究肝微粒体体外孵育氯丙嗪的代谢对于指导临 床用药具有重要意义&
药物代谢与排泄
注意区分代谢、排泄、消除三者之间的关系，消除包括代谢和排泄，其中代谢是指药物在体内经过药物代谢酶的作用结构发生改变，排泄是指药物以原型通过尿液、胆汁、粪便等途径排出体外，两者共同作用才导致药物的消除现象。
本文着重以口服药物的特征来描述药物代谢与排泄的过程，内容包括药物运动的物理过程、研究方法以及相应的应对策略。
∙肠代谢口服药物在小肠吸收部位跨过肠上皮细胞进入肝门静脉的过程中，会受到肠上皮细胞中药物代谢酶的作用，该过程成为肠首过，肠代谢酶的类型与肝药酶基本一致。
该过程一般采用肠微粒体代谢稳定性、在体肠灌流、肝门静脉插管等试验进行评价。
典型案例多表现为化合物溶解性、吸收性质均比较好，而门静脉血中药物浓度较低，整体体现为生物利用度较低。
在遇到类似案例时，早期可以结合代谢物鉴定结果修饰化学结构，后期可以改变给药方式来避免严重的肠首过效应。
∙肝代谢药物通过肝门静脉汇入肝脏，一部分游离药物经肝脏中CYP、UGT、non-CYP等酶代谢后形成代谢产物，部分药物以原型进入血液循环系统。
目前肝代谢的主要研究方法包括：体外肝细胞代谢稳定性、S9代谢稳定性、肝微粒体代谢稳定性、重组酶代谢稳定性等试验。
human主要研究的酶亚型包括：CYP1A2 2B6 2C8 2C9 2C19 2D6 3A4/5，要注意的是各个种属的代谢酶亚型的种类和分布并非完全一致。
当体外试验发现Ⅰ相代谢很稳定，而体内存在肝代谢的情况时，需要考察Ⅱ相或者non-CYP酶代谢的可能性。
主要经过肝代谢消除的化合物典型表现为体外代谢稳定性计算得到的CL大于或者接近于体内IV试验测得的CL，表现为胆汁和尿液中的原型药物较少。
根据我们的需求，当需要提高生物利用度或者暴露量时，早期可以结合代谢物鉴定结果修饰化学结构，阻断主要代谢位点，提高代谢稳定性；当需要化合物降低由代谢酶引起的DDI风险时，尽可能使化合物被多种亚型的代谢酶共同代谢，避免单一亚型酶受到诱导或者抑制时对化合物的PK有显著的影响。
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代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。
由此，代谢稳定性研究常作为早
期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。
目前常用
于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。
而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针
对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是
什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数
据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下
文将带着这些疑问进行阐述。
1 肝微粒体与肝细胞的差别
要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。
肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。
由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。
另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。
此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、
OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。
(摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies in
Drug Design and Development》一书)
（参考Membrane transporters in drug development一文）
2 LMS和HMS结果存在差异的原因
此处将LMS和HMS的差异的原因分为机制性的原因和经验性的原因。
2.1 机制性原因
当化合物的膜渗透能力较差或为外排转运体底物时，化合物由于在肝细胞体系中无法完全暴露于代谢酶中，会导致化合物在肝细胞中代谢速率较慢；
化合物主要经AO、UGT、MAO-A等non-CYP代谢酶代谢时，由于肝细胞中此类酶的含量高于肝微粒体，会导致化合物在肝细胞中代谢速率较快；
当化合物为肝脏主动摄取转运体时，并不会导致肝细胞代谢速率快于肝微粒体。
各类示例见下图
（参考Mechanistic insights from comparing intrinsic clearance values between human liver microsomes and hepatocytes to guide drug design一文）
2.2 经验性原因
另外有一些经验性的统计研究发现，LMS与化合物的理化性质、渗透性和酶表型有一定的关系，其中发现主要经CYP3A和UGT代谢的化合物其固有清除率LMS高于HMS。
（参考Evaluation of the Disconnect between Hepatocyte and Microsome Intrinsic Clearance and In Vitro In Vivo Extrapolation Performance一文）
3 应对LMS和HMS差异的策略
在面对LMS和HMS的差异时，我们主要是解决两个问题，1）在化合物筛选早期以哪个数据为准来进行化合物的ranking；2）在化合物开发阶段采用哪个数据来进行人体清除率的预测。
3.1早期优势化合物的筛选
在这个阶段当我们更多的是从筛选效率和成本来进行考虑，常规情况下LMS的通量和成本肯定明显优于HMS，但是当我们发现LMS的数据与HMS数据存在差异时，此时唯一遵循的原则是哪个数据和体内的相关性越好就选择哪个，此处提及的相关性更多指化合物在体外和体内ranking的一致性，并非IVIVE的定量关系，如果发现LMS的数据与体内清除率的相关性越好当然最好，如果发现HMS和体内清除率的相关性更好时我们应依据实际情况进行调整。
当化合物由于透膜性差所致的HMS慢于LMS，且体内清除率也较小，此时我们仍然可以保持LMS的筛选方式，即为比较保守的方式；当化合物存在non-CYP代谢导致HMS快于LMS时，且体内清除率也较大，此时应该绝对的放弃LMS，转而采用肝细胞，但是考虑到成本，亦可尝试肝脏S9。
此外亦可通过重组酶结合Met-ID的方式找到主要参与的non-CYP代谢酶，通过结构改造封堵代谢位点尽量避免该类结构的non-CYP代谢。
3.2 人体清除率的预测
除了异速放大的方法，一般多用基于LMS或HMS的IVIVE法进行人体清除率的预测。
在化合物开发阶段应尽可能研究清楚化合物在肝微粒体和肝细胞代谢差异的原因，在机制清楚的前提下进行人体清除率的预测，并更多地参考临床前各种属的体内外代谢的规律。
当由于化合物自身被动扩散能力所致的差异时，无需过多机制性的研究，仅仅需要依据临床前各种属的IVIVC关系选择LMS或HMS，以及合适的Scaling factors。
当化合物由于外排转运体所致的肝细胞较慢时，同样可以先依据临床前种属的关系进行选择，但同时需要进行转运体的
动力学数据测试，结合PBPK模型进行肝清除率的预测，以防止种属间转运体表达差异所致的预测偏差。
当化合物由于non-cyp代谢所致的肝细胞较快时，此时应放弃采用LMS数据进行人体清除率预测，选择采用HMS数据进行预测，若临床前各种属基于HMS的IVIVC关系较好时，即可用HMS数据进行预测并借鉴相应的scaling factors，若临床前各种属IVIVC关系不一致时，可以尝试采用重组酶的方法进行表征其代谢，结合PBPK模型进行清除率的预测。