实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
体外代谢产物实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外代谢实验，研究某种化合物在特定酶系作用下的代谢过程，鉴定其代谢产物，并分析其代谢动力学特性。
通过此实验，可以为该化合物的体内代谢研究提供实验依据，并为后续的药物研发和毒理学评价提供参考。
二、实验材料1. 实验化合物：待研究化合物A（纯度≥98%）2. 实验试剂：肝微粒体酶、NADPH、辅酶A、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠等3. 实验仪器：低温离心机、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）等4. 实验动物：比格犬（体重2-3kg）三、实验方法1. 肝微粒体酶的制备：取比格犬肝脏，剪碎后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制成匀浆，低温离心（10000g，4℃，10min）分离肝微粒体。
用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）调整肝微粒体蛋白浓度为10mg/mL。
2. 代谢反应：取肝微粒体酶溶液、NADPH、辅酶A和待研究化合物A，按一定比例混合，在37℃、pH 7.4的条件下进行代谢反应。
3. 代谢产物分析：代谢反应结束后，用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析代谢产物，鉴定其结构。
4. 代谢动力学分析：通过计算酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），分析酶的代谢动力学特性。
四、实验结果1. 代谢产物分析：实验结果显示，待研究化合物A在肝微粒体酶的作用下，产生了多个代谢产物，其中主要产物为B和C。
2. 代谢动力学分析：酶的米氏常数（Km）为0.5μM，最大反应速率（Vmax）为0.2μM/min。
五、讨论1. 本实验成功鉴定了待研究化合物A的代谢产物，为后续的体内代谢研究提供了实验依据。
2. 代谢动力学分析结果显示，该酶对化合物A的代谢动力学特性符合米氏方程，说明该酶对化合物A的代谢具有可逆性。
3. 通过比较不同酶系的代谢动力学参数，可以为药物研发和毒理学评价提供参考。
六、结论本实验通过体外代谢实验，研究了待研究化合物A的代谢过程，鉴定了其代谢产物，并分析了其代谢动力学特性。
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，其具有多种生物合成和代谢功能。
为了研究肝微粒体的结构和功能，科学家们开展了一系列的制备方法。
肝微粒体的制备方法主要包括离心法、差速离心法和梯度离心法。
离心法是最常用的制备方法之一。
首先需要从动物或人体中提取肝脏组织，然后将组织切碎并加入缓冲液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过不同离心速度和离心时间的调节，可以分离出肝微粒体。
差速离心法是离心法的一种改进方法。
该方法利用不同细胞器的密度差异，通过多次离心来进一步分离纯净的肝微粒体。
首先，将组织切碎并加入缓冲液进行离心，得到一个粗制的肝微粒体上清液。
然后，将上清液进行再离心，获得更纯净的肝微粒体。
通过多次离心，可以得到更高纯度的微粒体。
梯度离心法是一种更为精细的制备方法。
该方法利用不同密度的梯度溶液，通过离心使得细胞器分层。
首先，制备不同浓度的梯度溶液，然后将组织切碎并加入梯度溶液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过调节离心速度和时间，可以分离出纯净的肝微粒体。
肝微粒体的制备方法选择取决于研究的目的和需要。
离心法简单易行，适用于初步的制备。
差速离心法和梯度离心法需要更多的技术和设备支持，但可以得到更高纯度的肝微粒体。
在肝微粒体的制备过程中，需要注意以下几点。
首先，组织的采集和处理需要在低温和无氧条件下进行，以保持微粒体的完整性和活性。
其次，离心速度和时间的选择应根据具体实验要求进行调整，以获得最佳的分离效果。
此外，在制备过程中，需要注意避免污染和交叉感染，以确保实验结果的准确性和可靠性。
肝微粒体的制备是研究肝细胞生物学和代谢过程的重要工具。
离心法、差速离心法和梯度离心法是常用的制备方法，选择适合的方法可以得到纯净的肝微粒体。
在实验过程中，需要注意操作技巧和实验条件的控制，以确保制备的微粒体质量和纯度。
通过这些制备方法，科学家们可以更深入地研究肝微粒体的结构和功能，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
(仅供参考)实验4-肝微粒体制备
6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。
8.离心25000g/min, 15min；
9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用.
注意事项：
上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的!
4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
5.取上清离心（12000g,10min）；
6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。
7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀；
三、实验步骤
1. 处死小鼠；
2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。
3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
P450测定
背景知识
定义： 对药物转化起非专一性催化作用的肝脏微粒体混合功能系统
特点： 1. 酶系统的活性有限，个体差异大（先天、年龄的影响）， 种类多（150+种） 2. 酶活性易受某些药物的影响 3. 还原型P450可以与CO结合，吸收光谱的主峰在450nm的波 长处
3
实验目的
肝匀浆中细胞色素P-450含量的简易测定； 了解肝药酶的诱导剂、抑制剂对肝药酶含量的影响。
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① 取肝脏500 mg以上（不能破坏胆囊，用滤纸吸干余血），称重、记录 ② 置匀浆器中，加0.25 M蔗糖溶液（0.5 ml/100mg肝），冰浴研磨 ③ 双层纱布过滤匀浆液 ④ 取匀浆液1 ml，加Tris-HCl缓冲液 9 ml ，混匀。
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实验方法
5. 冰浴下充CO ，1-2气泡/秒，通气2 min（218室）
测定Pheno（P－450由低浓度至高浓度）。
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【讨论】 1、P-450在药物转化中的作用； 2、不同实验组P-450含量不同的原因； 3、诱导剂增加P-450含量、抑制剂减少P-450含量的意义；
【结论】 Pheno为肝药酶诱导剂，A.D为肝药酶抑制剂。
【示教】 小鼠断头放血，摘除胆囊，取肝，匀浆器使用。
6. 放入两个比色杯，一个做参照（不加入Na2S2O4 ）一个做样品（加入 Na2S2O4 5 mg）
7. 参照杯调零，在450 nm、490 nm处测定样品杯的吸光度（219室），记
录数据
P450 + CO
参照：不加Na2S2O4
比色： A450nm - A490nm
样品：加Na2S2O4
示差光谱法
P450
1
2
3
4ห้องสมุดไป่ตู้
肝微粒体制备
肝微粒体制备1. 简介肝微粒体（mitochondria）是细胞中的一种细胞器，主要负责细胞内能量的产生和调节。
肝微粒体制备是一种常用的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
本文将介绍肝微粒体制备的步骤和相关实验方法。
2. 肝微粒体制备步骤2.1 器材准备•洗涤缓冲液：含有0.25 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA 和0.1% BSA的缓冲液。
•离心管：用于离心过程。
•显微镜滑片：用于观察制备得到的肝微粒体。
2.2 肝脏取材•将新鲜动物（如小鼠）的肝脏取出，并放入冰冻盒中保持低温。
•快速切碎肝脏组织，以避免氧化酶的活性降低。
2.3 组织匀浆•将切碎后的肝脏组织加入洗涤缓冲液中。
•使用均质机将组织匀浆，以破碎细胞膜和释放肝微粒体。
2.4 离心分离•将匀浆后的混合液离心10分钟，以去除未破碎的细胞碎片和细胞核。
•将上清液转移到新的离心管中，并进行第二次离心，以沉淀肝微粒体。
2.5 肝微粒体收集•将离心得到的沉淀用洗涤缓冲液悬浮。
•用洗涤缓冲液洗涤肝微粒体，以去除杂质。
•最后一次离心后，将上清液倒掉，保留沉淀中的肝微粒体。
3. 肝微粒体制备相关实验方法3.1 蛋白含量测定•使用Bradford方法或BCA方法测定制备得到的肝微粒体中蛋白质的含量。
•根据实验需要调整蛋白质的浓度。
3.2 肝微粒体功能检测•使用荧光探针（如JC-1）检测肝微粒体的膜电位。
•使用呼吸链底物（如琥珀酸、NADH）测定肝微粒体的呼吸功能。
3.3 肝微粒体结构观察•使用透射电子显微镜观察制备得到的肝微粒体的形态和结构。
•准备样品时要注意避免溶剂残留和样品的干燥。
4. 结论肝微粒体制备是一种重要的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
通过合理的步骤和实验方法，可以成功制备得到高质量的肝微粒体，并进一步开展相关实验研究。
了解肝微粒体的制备过程对于深入理解细胞内能量代谢和调节机制具有重要意义。
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
细胞色素P450含量测定
细胞色素P450酶含量的测定步骤一．微粒体的制备1.PH=7.4磷酸缓冲液的配制1.36g磷酸二氢钾+0.1mol/L NaOH(aq)79ml, 用水稀释至200ml即可。
悬浮液：7.5ml磷酸缓冲液+2.5ml甘油混合，即可。
2.取植物幼苗1g，放在预冷的研体中研磨并加入预冷缓冲液4ml。
3.把匀浆离心（9000r/min）15min，再取上清液离心（100000r/min）60min,弃上清液，得沉淀。
4.然后加适量悬浮液进行悬浮，后-80C下保存。
5.微粒体蛋白浓度用Bradford法测定。
注：以上操作均在4C下完成。
二．蛋白质含量的测定1.蛋白质染色剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，待用时将溶液稀释到1000ml。
2.标准曲线制备（1）.称取50mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容到50ml容量瓶中，配成浓度为1mg/ml的标准蛋白溶液。
（2）.取7支试管分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml 1mg/mL标准液，用蒸馏水补足2ml。
（3）.取8支试管，0号试管加0.1ml的蒸馏水，1—7号试管分别加入0.1ml（2）中的标准蛋白稀释液，然后加5ml考马斯亮蓝染色剂，充分振荡，反应2分钟后于595nm处测定吸光值。
绘制标准曲线。
3.样品蛋白含量测定将样品稀释到蛋白浓度约为0.1—0.8mg/ml，取0.1ml样品再加5ml考马斯亮蓝G-250，混匀后振荡，反应2分钟后于595nm处测定OD值，以蒸馏水为空白凋零。
在依据标准曲线，算出样品蛋白浓度。
三．P450酶含量测定：用PH=7.4的磷酸缓冲液将微粒体细胞色素P450酶液稀释到蛋白浓度为1mg/mL，加入4mg连二亚硫酸钠，反应4min，将其平分到比色皿中，在紫外分光光度计上扫描基线，然后向样品杯中通入CO 30s，稳定5min，在波长400—500nm范围内扫描得到P450-CO复合物吸收光谱。
去氢厄弗酚在小鼠肝微粒体中代谢产物及CYP450酶亚型的鉴定
去氢厄弗酚在小鼠肝微粒体中代谢产物及CYP450酶亚型的鉴定王勤辉;张婵溪;高伟;王晓烨;孙璐;王小红;黄建梅【摘要】Objective To establish a method for identification of the dehydroeffusol (DHE) metabolites in mice liver microsomes, and to identify the CYP450 isoforms involved in DHE metabolism.Methods The DHE metabolites in vitro incubated in liver microsomes were identified by UPLC-Q-TOF-MS/MS,and 7 types of CYP450 isoforms were screened out,the specific chemical inhibitors were used to identify the CYP450 isoforms involved in DHE metabolism.Results 4 metabolites were detected after in vitro incubation with mice liver microsomes.In the 7 CYP450 isoforms screened,CYP1A2,CYP2C8 and CYP2D2 were highly involved in the metabolism of DHE in liver microsomes.Conclusion In liver,there are a several subtypes of CYP450 enzymes involved in the metabolism of DHE metabolism,indicating that DHE is difficult to interact with other drugs in clinical.%目的建立去氢厄弗酚(DHE)小鼠体外肝微粒体孵育方法,鉴定DHE在小鼠肝微粒体中的代谢产物及参与DHE代谢的CYP450酶亚型.方法采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析鉴定DHE在体外肝微粒体共温孵后的代谢产物,筛选7种CYP450酶亚型,并通过特异性化学抑制剂法,鉴别参与DHE代谢的主要CYP450酶亚型.结果在体外肝微粒体共温孵后,检测到4个代谢产物;所筛选的7种CYP450酶亚型中,CYP1A2、CYP2C8和CYP2D2对DHE体外肝微粒体代谢的参与度较高.结论在肝脏中,有多种代谢酶亚型参与DHE的代谢,表明DHE在临床上不易与其他药物产生相互作用.【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2017(032)003【总页数】4页(P350-353)【关键词】去氢厄弗酚;代谢产物;CYP450;UPLC-Q-TOF-MS/MS;特异性化学抑制剂【作者】王勤辉;张婵溪;高伟;王晓烨;孙璐;王小红;黄建梅【作者单位】北京中医药大学中药学院,北京 100102;北京中医药大学中药学院,北京 100102;北京中医药大学中药学院,北京 100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京 100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京 100102【正文语种】中文【中图分类】R914去氢厄弗酚(dehydroeffusol，DHE)是中药灯心草中清心除烦作用的有效成分，也是灯心草中含量较高的菲类成分之一，研究表明，DHE具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗藻和细胞毒活性作用[1-6]，开发应用前景良好[7]。
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院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
1 实验目的
本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理
研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。
细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。
根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料
3.1实验动物
大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）
3.2实验器材与试剂
器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等
试剂：1.17% KCl 溶液
Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；
水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml
4.实验方法
4.1动物处理与匀浆制备
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。
肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）
的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液
将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，
上清液即为线粒体后上清液。
温度为0～4℃；离心力10 000～12 500g；时间
15～30min
4.3制备微粒体-超速离心法
取线粒体后上清液8～12mL，置超离心管；离心 100 000g 60min，弃上清
液；微粒体板用0.25mol/L蔗糖液或1.17％KCl液洗1次，以除去污染的血红蛋
白再离心 100 000g 30～60min，弃上清液；微粒体板沉淀物移至离心管，加适
量pH 7.4 Tris-HCl缓冲液重悬，终产物为微粒体悬液制备的肝微粒体每1g含
蛋白一般在20mg左右；最好当天使用。
若保存，应加20％（V/V）甘油分装于
塑料管，置-20~-80℃，可保存数周而酶活性不减。
4.4微粒体蛋白浓度测定
1.微量法制定标准曲线取8个1.5ml离心管，分别编号0-7，按下表配制
浓度梯度标准蛋白溶液。
表1 浓度梯度标准蛋白溶液
样品编号0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液
0 25 50 100 200 300 400 500
(μL)
Tris-HCl缓冲
1000 975 950 900 800 700 600 500 液(μL)
标准蛋白浓度
0 0.025 0.050 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
（mg/ml）
考马斯亮蓝试
200
剂(μL)
取上述各浓度蛋白标准稀释液20μL 与考马斯亮蓝染色剂200μL至96孔酶标
板内，各设三个重复孔，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于
595nm处比色测定各孔OD值。
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，
在坐标纸上绘制标准曲线。
2.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，分别取肝微粒体悬液100倍和
200倍稀释液20μL，测定OD595nm值，平行测定三次。
根据所测定的平均OD595nm
值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓
度(mg/mL)。
4.5细胞色素P-450含量测定
取蛋白含量已知的组织样品用pH7.4 0.1mol/L Tris缓冲液(1.21g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至100ml稀释为每1mL含 10mg微粒体蛋白的悬液；取此液0.3mL，加上述缓冲液5.7mL，混合；分装于2个比色杯（大约3mL），一个作为样品杯，另一个作为参比杯，置双光束紫外分光光度计，扫描400和500nm间的基线；加数mg连二亚硫酸钠，搅拌，样品杯轻轻充CO约1min，再扫描400～500nm的差示光谱。
4.6结果计算
P-450含量＝△OD（450-490）×1000/91×蛋白浓度C × r （mg/ml）×
稀释倍数（ nmol/mgPr）
ΔOD为450nm处光密度值与490nm光密度值之差 91为CYP450的消光系数，单位：cm2／mmol
r为比色杯光径长度，单位：cm
C为微粒体制备物的蛋白浓度，单位：mg／ml
5.实验结果
5.1 标准曲线的绘制
Bradford法测定标准蛋白结果和标准曲线见表2和图1
表2标准蛋白595nm的OD值
标准蛋白浓度
0.025 0.050 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 （mg/mL）
吸光度A0.399 0.477 0.561 0.684 0.763 0.836 0.882 以表2的数据绘制标准曲线如下。
图1标准曲线
5.2．未知样品蛋白质浓度的测定结果
表3 未知样品蛋白质浓度595nm的OD值
溶液测定校正值校正均值稀释100倍0.942 0.951 0.951 0.967
1.013 0.976 0.970
稀释200倍0.807 0.809 0.808 0.814
0.793 0.824 0.841
根据所测定的平均OD595nm校正值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，计算出稀释100倍和200倍的蛋白浓度分别为53.96mg/ml，76.83mg/ml。
因此，未知样品的蛋白浓度: 65.40mg/ml
5.3 细胞色素P-450含量测定
由于实验过程中未充入CO ，因而未能测定细胞色素P-450,但是在420nm 波长下测得细胞色素B5的差值光谱。
图2 双光束紫外分光光度计测得细胞色素B5的差示光谱（0.5mg/ml）
OD值峰值（424nm）：0.0197；谷值（490nm）：0.00547。
6 实验讨论
肝微粒体是肝细胞中内质网的亚细胞组分，含有丰富的药物代谢酶：其中细胞色素P450酶广泛的参与了各种物质的生物合成和代谢；肝S9是肝匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶。
因此，微粒体是非常有价值的研究药物代谢和药物相互作用的工具。
实验注意：操作的全过程及所用器械、人；溶液均应维持在0℃～4℃范围内，匀浆器始终应浸在冰水浴中，以避免肝微粒体酶因热变性而失活。
制备无菌微粒体，需对所使用的全部器材和溶液进行灭菌处理。
细胞色素P-450含量依组织、动物是否诱导、种属、品种等而定，一般未诱
导的大、小鼠肝细胞色素P-450含量为0.4～1.0nmol/mg微粒体蛋白。
为避免血红蛋白破坏，保险粉加入不宜过多。
在缓冲液中加20％甘油可减少转化为无活性的细胞色素P-420，一般测定不需加甘油。
样品与保险粉混合后应尽快充CO，因细胞色素P-450的还原形式不太稳定；充CO时速度宜慢，以免泡沫太多导致蛋白变性。
充CO后如果420nm处吸收峰比较明显，表明有失活的细胞色素P-450，样品不能使用。
本次试验中，在测定蛋白浓度的时候，由于考马斯亮蓝试剂保存时间太长，使得测定的蛋白浓度不准确；在测定P-450含量时，由于外部原因并没有充入CO，因而分光光度计在450nm处并没有出现峰值，而是在424nm处出现峰值，经查是细胞色素B5的峰值。
细胞色素B5也存在于肝微粒体中，还原型b5与氰感受因子的酶一起，参与由氧将饱和酰基辅酶A转变成不饱和酰基辅酶A的脂肪酸不饱和化反应。
通过测定一系列蛋白浓度浓度的差示光谱，确定了当蛋白浓度为0.5mg/ml时的光谱图效果比较好，该谱在紫外区的吸收杂峰不很明显，并且有着很明显的波峰和波谷，效果理想。