实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定

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新药药理毒理研究、分类及申报要求

新药药理毒理研究、分类及申报要求
主要内容
新药研究概述新药的药理研究新药的安全性评价新药注册分类及申报资料要求 GLP简介
一、新药研究概述
➢ 新药定义：
新药（New Drugs）是指化学结构、药品组分和药理作用不同于现有药品的药物。根据《药品管理法》以及2007年10月1日开始执行的新《药品注册管理办法》，新药系指未在中国境内上市销售的药品。对已上市药品改变剂型、改变给药途径、增加新适应症的药品，亦属于新药范畴。
（2）以整体动物为好，“至少有一种整体动物模型”。
（3）离体器官可以作为药效学评选模型，试管内也可评选药物的药理作用，但其基本反应性质必须是和整体情况下一致的。
（4）注意整体动物模型和各种体外模型的药理反应之间的差别。如磺胺药体外作用极弱，而体内有效。对病毒体外筛选有效药很多，但体内无效。抗肿瘤药物也是
2.动物选择
常用大鼠、Beagle犬、猴；也用小鼠、小型猪、新西兰兔
3.剂量组别设计
一般为四组，供试品设高、中、低三个剂量组，外加溶剂对照组；复方制剂设单方对照组，手性药物设消旋体对照、改剂型或改给药途径药物设原制剂对照。高剂量要出现明显的毒性反应，低剂量最低等同于药效学起效剂量，必须是安全剂量，剂距可以根据药物情况灵活设计，一般为2-5倍。也可以不等比例。
急性毒性是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应。初步阐明药物的毒性作用。对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量所致急性中毒相关的信息。
急性毒性试验方法
经
最
限
近
金
上
累
典急性毒性试

肝脏蛋白的提取和浓度测定

1.肝脏组织的提取
组织取材
操作步骤
超声匀浆冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠肝脏组织，用灭菌的剪刀将组织块尽量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀浆器进行匀浆,超声每次10秒，重复3次
考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年由 Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
肝脏蛋白的提取和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握蛋白质的提取方法
了解掌握考
马斯亮蓝法（Braford法）测定蛋白质
含量的原理和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白的提取
◆蛋白的浓度测定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠（sodium deoxycholate）, 0.1% SDS，得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。

动物肝脏的提取实验报告

动物肝脏的提取实验报告一、实验目的本次实验旨在通过一系列操作流程，从动物肝脏中提取有效成分，并对提取过程和结果进行详细记录和分析。

二、实验材料与设备1、实验动物：新鲜的猪肝（来自健康的成年猪）2、实验试剂：生理盐水、乙醇、丙酮、氯仿、蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液（PBS）等。

3、实验设备：离心机、匀浆机、电子天平、移液器、恒温水浴锅、真空冷冻干燥机、分光光度计、显微镜等。

三、实验步骤1、肝脏获取与预处理从市场购买新鲜的猪肝，确保其来源健康且无病变。

将猪肝用生理盐水冲洗干净，去除表面的血迹和杂质。

用剪刀将猪肝剪成小块，放入预冷的匀浆器中。

2、组织匀浆在匀浆器中加入适量的生理盐水，以1:3（组织质量:生理盐水体积）的比例进行匀浆。

启动匀浆机，将猪肝充分匀浆至细腻均匀的状态。

3、离心分离将匀浆液转移至离心管中，在 4℃下，以 3000 rpm 的转速离心 15分钟。

离心后，分为三层，上层为脂肪和杂质，中层为上清液，下层为沉淀。

小心吸取上清液，转移至新的离心管中。

4、蛋白提取在上清液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白质降解。

缓慢加入适量的乙醇，使乙醇终浓度达到70%，搅拌均匀后，在 4℃下静置 2 小时，使蛋白质沉淀。

5、再次离心将上述混合液在 4℃下，以 5000 rpm 的转速离心 20 分钟。

离心后，弃去上清液，收集沉淀。

6、溶解与透析将沉淀用适量的 PBS 溶液溶解，搅拌均匀。

将溶解后的溶液装入透析袋中，在 4℃下，用 PBS 溶液进行透析，每 4 小时更换一次透析液，透析 24 小时，以去除小分子杂质。

7、浓缩与干燥将透析后的溶液进行真空浓缩，至体积减少至原来的 1/5 左右。

将浓缩液放入真空冷冻干燥机中，干燥至粉末状，得到肝脏蛋白提取物。

四、实验结果与分析1、蛋白含量测定采用 Bradford 法测定提取的蛋白含量，结果显示蛋白浓度为____mg/ml。

与预期的蛋白含量相比，本次提取的蛋白产量略低，可能是在匀浆或离心过程中有所损失。

两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较

两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【期刊名称】《现代预防医学》【年(卷),期】2006(33)4【摘要】目的:通过比较联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的S9的活化作用,探讨两种S9活化作用的差异对两种试验阳性结果的影响。

方法:采用Ames试验方法和染色体畸变试验方法对两种S9活化的阳性结果进行比较。

Lowry法测定两种S9的蛋白含量,Omura法测定P450含量。

结果:Ames试验和染色体畸变试验中两种S9在阳性组中都显示出明显活化作用,同一条件下,Ames试验中使用两种S9所得阳性结果并无较大差异,染色体畸变试验中两种S9活化的阳性组畸变率间差异无统计学意义(P>0·05)。

多氯联苯诱导法S9的蛋白含量13·25g·L-1,P450含量为3·92nmol·mg-1蛋白,联合诱导法S9蛋白含量为15·25g·L-1,蛋白含量P450含量为2·94nmol·mg-1蛋白。

结论:两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对相应阳性诱变剂都有明显的活化作用。

可以认为两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对于相应的阳性化学物活化作用无较大差异,联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。

【总页数】4页(P457-459)【关键词】联合诱导法;多氯联苯诱导法;肝S9;Ames试验;染色体畸变试验;Lowry 法;Omura法【作者】王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【作者单位】四川大学华西医学中心公共卫生学院;国家成都中药安全性评价中心【正文语种】中文【中图分类】R99【相关文献】1.不同诱导方法制备大鼠肝微粒体酶及其活性的比较 [J], 高梅;曹冲;英永;马会;贾庆文2.联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定 [J], 余大为;侯言东(通讯作者)3.螺旋涂布法评价联合诱导制备大鼠肝 S9的活性大小 [J], 单纯;张凤兰;崔生辉4.自拟通络祛浊方对两种不同方法诱导大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型的干预效果及机制研究 [J], 金毅;吕爱贞;黄宝明;邢伟;郑又铭;张金龙;杨雯;徐愉林;李静5.在鼠伤寒沙门氏菌致突变试验中比较人肝细胞和人肝S9与大鼠肝制剂活化系统对激活诱变剂的影响 [J], 王国钦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定

S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【摘要】目的:研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法:采用苯巴比妥钠作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果:成功制得大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论:苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(036)002【总页数】3页(P243-245)【关键词】S9制备;蛋白含量测定【作者】何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【作者单位】西南民族大学化学与环境保护工程学院,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R9许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法.1.1 药品与试剂KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ, nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)1.2 仪器冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计() 1.3 实验动物Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)2.1 肝酶系统的诱导用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.2.2 大鼠肝S9的制备取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化. 将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢酶活化系统[5,6].2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量2.3.1 标准曲线的绘制取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定). 以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：0.1mg/ml-0.5mg/ml.3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.【相关文献】[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.。

westernblot法检测大鼠肝组织血清蛋白的表达变化

westernblot法检测⼤⿏肝组织⾎清蛋⽩的表达变化Western-blot⼀、实验⽬的1、⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析2、⽬的蛋⽩与其他蛋⽩的相互作⽤⼆、实验原理在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测的⼀项技术。

与Southern Blot或Northern Blot杂交⽅法类似，但Western Blot法采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。

经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。

Western Blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：i. 放射⾃显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈⾊现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊，体同⽔平和实验条件的是⽤第⼀种⽅法，发表⽂章通常是⽤底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就⾏，操作也⽐较简单，原理如下（⼆抗⽤HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁⽶诺，如遇到HRP，即发光，可使胶⽚曝光，就可洗出条带。

三、实验器材及试剂1、器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及⽔浴锅⽤试管架（3）定时器，记号笔，⼀次性⼝罩和筒纸（4）于冷室中预冷的1.4万转台式离⼼机（5）PH试纸（6）分光光度仪，⽯英⽐⾊杯（7）烧杯，量筒，棕⾊试剂瓶（8）0.45um滤纸2、主要试剂(1)⼀抗：⼩⿏抗⼤⿏多克隆抗体（清蛋⽩，分⼦量66kD）(2)⼆抗：⽺抗⼩⿏IgG-HRP(3)定蛋⽩试剂盒：南京建成⽣物⼯程研究所。

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

至肉汤中.37'G振荡培养10小时。存活细菌密度可达1---2 X 109 l mI o
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突

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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。