酪蛋白的初步鉴定
牛奶中酪蛋白含量的测定
牛奶中酪蛋白含量的测定牛奶是一种营养丰富的饮品，其中富含多种蛋白质，而酪蛋白是牛奶蛋白质中的主要成分之一。
准确测定牛奶中酪蛋白的含量对于评估牛奶的质量、了解其营养价值以及在相关的食品加工和研究中都具有重要意义。
酪蛋白是一种磷蛋白，在牛奶中以胶束的形式存在。
它的性质相对稳定，在一定的条件下可以从牛奶中沉淀分离出来。
目前，测定牛奶中酪蛋白含量的方法主要有以下几种：一、等电点沉淀法酪蛋白在其等电点（pH 46 48）时溶解度最低，容易沉淀析出。
实验操作时，首先将新鲜牛奶用脱脂棉过滤，以去除其中的杂质。
然后将牛奶缓慢加入到预先调节好 pH 值至 46 48 的醋酸醋酸钠缓冲溶液中，并不断搅拌。
搅拌均匀后静置一段时间，使酪蛋白充分沉淀。
接着通过离心分离的方式将沉淀的酪蛋白收集起来，用蒸馏水多次洗涤，以去除残留的乳清蛋白和其他杂质。
最后将沉淀烘干至恒重，通过称重计算出酪蛋白的含量。
这种方法的优点是操作相对简单，成本较低。
但缺点是沉淀过程中可能会有少量的乳清蛋白一同沉淀下来，导致测定结果偏高。
二、盐析法盐析是指在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，以破坏蛋白质的水化膜并中和其电荷，从而使蛋白质沉淀析出。
对于牛奶中酪蛋白的测定，可以使用硫酸铵等盐类进行盐析。
实验时，将牛奶与一定浓度的硫酸铵溶液混合，搅拌均匀后静置一段时间，使酪蛋白沉淀。
同样通过离心、洗涤、烘干等步骤，最终得到酪蛋白的质量并计算其含量。
盐析法的优点是沉淀效果较好，能够较为有效地分离酪蛋白。
但需要注意的是，盐的浓度和使用量需要严格控制，否则可能会影响测定结果的准确性。
三、电泳法电泳是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反的电极移动的现象。
利用电泳技术可以分离和测定牛奶中的酪蛋白。
首先，对牛奶样品进行预处理，使其中的蛋白质溶解并带电。
然后将处理后的样品加入到电泳槽中，施加电场。
由于酪蛋白和其他蛋白质的带电性质、分子量等不同，它们在电场中的迁移速度也不同，从而实现分离。
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离和鉴定
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离和鉴定肖丽王进（武汉大学化学与分子科学学院，2001级化学基地班）摘要：本文用实验的方法分离出牛奶的主要组成物质酪蛋白和乳糖，并用其特征反应和化学特性定性定量地检验了所分离的产物。
关键词：酪蛋白，乳糖，等电点，纸电泳，分离。
1 引言牛奶是一种营养价值丰富且易被人体吸收的物质。
现代研究表明，牛奶中所含的水，蛋白质，脂肪，糖，无机盐，维生素等都容易被人体吸收利用，除具有较高的营养价值外，对一些疾病还有一定治疗作用和保健养老作用。
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，是含磷蛋白质的复杂混合物，在牛奶中以钙盐存在。
酪蛋白是两性化合物，当调节牛奶的pH值到酪蛋白的等电点（pH=4.8）时，酪蛋白呈电中性，这时酪蛋白的溶解度最小，会从牛奶中沉淀出来。
本实验利用酪蛋白的这种性质对其进行分离。
酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，因此分离后用乙醇和乙醚洗去其中残留的脂肪。
牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种还原性二糖，是目前唯一由哺乳动物合成的糖，以α-乳糖和β－乳糖两种同分异构体存在，在水溶液中两种乳糖可以相互转化，故水溶液有变旋光现象。
乳糖不溶于乙醇，本实验使用乙醇使它结晶，达到分离目的。
2 实验部分2.1 原料和仪器50 ml烧杯, 100 ml量筒，数字旋光异仪，蒸发皿，水浴锅，电泳仪，精密PH 试纸，简单抽滤装置。
冰HAc，95%乙醇，新鲜牛奶（伊利牌），碳酸钙，乙醚，考马斯亮蓝试剂，硫酸铜，氢氧化钠。
2.2 分离实验（1）酪蛋白的分离：步骤：取20ml新鲜牛奶于50ml烧杯中，在恒温水浴中加热到50ºC，不断搅拌下滴加10%HAc,用精密PH试纸调节牛奶的PH值至4.6~4.8（理论等电点pH=4.8，此步操作见后讨论），空气中放置一段时间冷却，之后过滤出其中的酪蛋白（滤液中加少量碳酸钙，留做下部实验用），依次用乙醇，乙醇和乙醚等体积混合液，乙醚洗涤酪蛋白，除去其中的脂肪，将其转入到表面皿上，在空气中风干后称重，得酪蛋白1.4218 g。
酪蛋白的制备实验报告
酪蛋白的制备实验报告
实验目的，通过酸性条件下酪蛋白的沉淀和洗涤，掌握酪蛋白的制备方法，并
对其纯度进行初步检测。
实验原理，酪蛋白是存在于乳制品中的一种蛋白质，它在酸性条件下会发生沉淀。
在本实验中，我们将利用这一特性来制备酪蛋白。
首先将乳清酸化至pH4.6以下，使酪蛋白发生沉淀，然后进行洗涤和干燥，最终得到酪蛋白的粗品。
实验步骤：
1. 准备工作，取适量乳清，准备醋酸和蒸馏水。
2. 酸化，将乳清倒入容器中，加入适量的醋酸，搅拌均匀，使其pH值降至4.6以下。
3. 沉淀，将酸化后的乳清静置一段时间，观察到白色沉淀物即为酪蛋白。
4. 洗涤，用蒸馏水将沉淀物洗涤数次，去除余酸和杂质。
5. 干燥，将洗涤后的酪蛋白沉淀放置于通风处自然干燥，直至完全干燥。
实验结果，通过上述步骤，我们成功地制备出了酪蛋白的粗品。
经过初步检测，得到的酪蛋白呈现白色粉末状，无异味，初步符合酪蛋白的特征。
实验结论，本实验通过酸化乳清的方法，成功制备出了酪蛋白的粗品，并进行
了初步检测。
制备过程简单，操作方便，得到的酪蛋白粗品可用于后续的纯化和分析。
实验注意事项：
1. 实验过程中需注意安全，避免醋酸溅入眼睛或皮肤。
2. 实验操作需在通风处进行，避免吸入醋酸蒸气。
3. 酪蛋白粗品需储存在干燥通风处，避免潮湿和阳光直射。
通过本次实验，我们成功掌握了酪蛋白的制备方法，并对其纯度进行了初步检测。
这对我们进一步深入了解酪蛋白的性质和应用具有重要意义。
希望本实验能为相关研究和应用提供一定的参考价值。
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离和鉴定
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离和鉴定学生：指导教师：[摘要]：通过调节牛奶的pH法分从牛奶中离出酪蛋白和乳糖,并对其进行鉴定[关键词]：牛奶；酪蛋白；乳糖；分离；鉴定牛奶是一种营养价值很高的食品，主要由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，含量约为2.6g／100mL，占牛奶中蛋白质总量的80％。
酪蛋白含有人体必需的8种氨基酸，极易消化吸收，是优质氨基酸供给源，成为婴幼儿及幼畜的主要蛋白源，牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种二糖，它是唯一由哺乳动物合成的糖，它是在乳腺中被合成的。
乳糖是成长中的婴儿建立其发育中的脑干和神经组织所需的物质。
由于酪蛋白与乳糖在食品加工、医药等领域具有广泛的用途，所以对分离方法的研究具有重要的经济效益和社会效益。
1．原理部分牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白，约占牛奶含量的34％，实际上，酪蛋白是含磷蛋白质的复杂混合物，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。
利用蛋白质在等电点时溶解度较小的特性，把牛奶的PH值调到酪蛋白的等电点(PH=4.8)来沉淀分离酪蛋白：酪蛋白不溶于乙醇，所以可用乙醇将其中的脂肪洗涤除去。
乳糖也是不溶于乙醇的，所以当乙醇混入水溶液中时，乳糖会结晶出来，扶而达到分离的目的。
2.实验部分2.1实验试剂醋酸、无水乙醇、95％乙醇、乙醚、碳酸钙等均为分析纯；市售袋装纯牛奶。
2.2实验仪器烧杯(600ML)；温度计；420A酸度计；SHZ—D(HI)真空抽气泵；恒温水浴锅；白纱布；布氏漏斗；锥形瓶；表面皿。
2.3实验方法2.3.1酪蛋白的提取取 100mL新鲜纯牛奶于250mL烧杯中，恒温水浴加热至40℃后加入 10％醋酸溶液，调pH值至其等电点附近(PH=4.8)。
用纱布过滤，用少量水洗涤沉淀2—3次。
加人30mL95％的乙醇，搅拌后用布氏漏斗过滤，用乙醚和乙醇等体积混合液20mL洗涤沉淀2次，用 15mL乙醚分2次洗涤酪蛋白，用布氏漏斗过滤，把固体转移到表面皿上，放于恒温干燥箱中干燥 1d。
牛奶中酪蛋白含量的测定
牛奶中酪蛋白的提取及含量测定一、实验原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。
2、等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。
同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。
3、酪蛋白的提纯根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。
4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。
在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离与鉴定
牛奶中酪蛋白和乳糖的分离与鉴定梁焱科张翔（武汉大学化学与分子科学学院，430072）摘要：牛奶是一种营养价值很高的食品，它主要是由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。
本实验完成了对牛奶中酪蛋白和乳糖的分离和检测，锻炼了我们的动手能力和在实验中分析问题的能力。
关键词：牛奶，酪蛋白，乳糖，分离与检测一、前言牛奶是营养最完备的食品之一，这一点己为许多人认识并接受。
尤其是在婴儿及青少年时期，每大一定量的牛奶能促进身体健康成长。
牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质。
牛奶是一种均匀稳定的悬浮状和乳浊状的胶体性液体，牛奶主要由水、脂肪、蛋白质、乳糖和盐组成。
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，是含磷蛋白质的复杂混合物。
蛋白质是两性化合物，当调节牛奶的pH值达到酪蛋白的等电点（pH=4.8）时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会从牛奶中沉淀出来，以此分离酪蛋白。
因酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，可用此两种溶剂除去酪蛋白中的脂肪，牛奶中酪蛋白的含量约为3.4%。
牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种二糖，它是唯一由哺乳动物合成的糖，它是在乳腺中被合成的。
乳糖是成长中的婴儿建立其发育中的脑干和神经组织所需的物质。
乳糖也是不溶于乙醇的，所以当乙醇混入水溶液中时乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
乳糖是由D-半乳糖分子C，上的半缩醛羟基和D-葡萄糖分子C4上的醇羟基脱水通过β-1，4苷键连接而成。
乳糖是还原性糖，绝大部分以α-乳糖和β-乳糖两种同分异构体形态存在，α-乳糖的比旋光[α]D20=+860, β-乳糖的比旋光[α]D20=+350，水溶液中两种乳糖可互相转变，因此水溶液有变旋光现象。
牛奶中乳糖的含量约为4-6%。
乳糖的溶解度20℃时为16.1%。
二、实验部分⒈牛奶中酪蛋白的分离①取100mL新鲜伊利牛奶，在恒温水浴中加热至40℃，边搅拌边慢慢加入10%醋酸溶液，用pH计测量其pH值，使其在4.8左右，放置冷却、澄清后，抽滤。
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
O CH2CH3
Coomassie G-250
NH
+
CH3
CH3
C
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Amax = 595nm
Protein - Dye Complex
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定
五 思考题
❖ 用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序 是否可以变换？为什么？
❖ 试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质 的实验
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定
六 离心机的使用及注意事项
❖ 离心机的工作原理：在离心力场的作用下，可加速悬浮液中固体颗粒 沉降或漂浮的速度，从而将不同的物质分离。它是生化实验中提取、 分离、纯化的常用设备，操作的关键环节是平衡。
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定
六 722型分光光度计使用方法
1．调整 （1）将灵敏度旋钮调至“1”档（放大倍率最小）。调波长调节器至所需
波长。 （2）开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，调节透光率[100%T]
旋钮使数字显示[100.0]左右，预热20min . 2．校正 （1）打开吸收池暗室盖（光门自动关闭），调节[0% T]旋钮，使数字
❖ 水分测定法通常可分为直接法和间接法两类。 利用水分本身的物理性质和化学性质测定水分的方法，叫 做直接法，如重量法，蒸馏法和卡尔.费休法等； 利用食品的比重，折射率，电导，介电常数等物理性质测 定水分的方法，叫做间接法。测定水分的方法要根据食品 的性质和测定目的来选定
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定
实验一 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定
[制备酪蛋白+双缩脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加纳+1%KOH）=？]
10
五、实验结果、计算与分析
结果一：酪蛋白的制备： 1、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL
2、酪蛋白得率=测定含量/理论含量×100%
牛乳酪蛋白理论含量为3.5g/100mL
结果二：酪蛋白的溶解度鉴定：
2
二、实验原理
1.牛乳中酪蛋白制备 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电 点为4.7-4.8。利用等电点时溶解度最低的原理，将 牛乳的pH调至4.7-4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用 乙醇洗涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质后便可得到 纯的酪蛋白。
二、实验原理
12
1.酪蛋白溶于哪些溶液？
蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及 饱和氢氧化钙（表格形式，状态：不溶解，部分溶解，全部溶解）
结果三：酪蛋白的双缩脲反应：
4、酪蛋白的双缩脲反应分析。（颜色描述并分析）
（为何酪蛋白与双缩脲试剂反应呈现紫红色？）
11
六、思考题
1、为什么调整溶液的pH值可以将酪蛋白沉淀出来？ 2、氨基酸是否能发生双缩脲反应？为什么？
7
四、实验步骤
1、酪蛋白的制备：
（3）往沉淀物中加入5mL蒸馏水，混匀后2000r/min 离心5min， 弃去上清液。
（ 4 ） 将 洗 净 的 沉 淀 物 加 入 3mL无 水 乙 醇 ， 混 匀 后 2000r/min离心5min， 弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。
（5）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于 25℃烘箱中烘干。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酪蛋白
内容提要：蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。
蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。
这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。
在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。
牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
酪蛋白是白色、无味的物质。
不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。
牛乳在pH 4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。
乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。
提取到酪蛋白后，可以用双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应来鉴定分析。
关键词：酪蛋白制备定性分析鉴定
1、实验目的
（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
（2）对酪蛋白进行分析鉴定。
2、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白食一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
双缩脲：尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与铜离子结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
茚三酮反应：一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨分子和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
反应的适宜ｐＨ为５－７，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ｐＨ条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
3、实验试剂、材料与器材
3、1试剂与材料
牛奶、95%乙醇、无水乙醚、乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1 V/V）、
0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液
（先配制A液与B液。
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称醋酸钠晶体54.44g，定容至2000mL。
B液：0.2mol/L醋酸溶液称优级纯醋酸年（含量大于99.8% ）12.0g定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。
）
2%卵清蛋白溶液、10%氢氧化钠溶液、茚三酮溶液、甘氨酸溶液、苯酚溶液、浓硝酸溶液、色氨酸溶液
3、2器材
离心机、精密pH试纸、烧杯、抽滤装置、电炉
4、实验内容
4、1酪蛋白的制备
（1）将25mL牛奶加热至40℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7醋酸缓冲液25mL。
用精密试纸或酸度计调pH值至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15min(3000r/min)。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
（2）用水洗沉淀三次，离心10min(3000r/min)，弃去上清液。
（3）在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。
最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
（4）取1g酪蛋白，称湿重，进行鉴定。
加入100mL蒸馏水，制成1%酪蛋白溶液。
4、2定性分析
（1）双缩脲反应：取两支洁净的试管编号为１、２，分别加入1mL酪蛋白溶液和1mL卵清蛋白溶液，再分别加入2mL10%氢氧化钠和2滴硫酸铜溶液，观察现象。
（2）茚三酮反应：取三支洁净的试管编号为１、２、３，分别加入1mL酪蛋白溶液、1mL卵清蛋白溶液和1mL甘氨酸溶液，再分别加入0.5mL茚三酮溶液。
用沸水浴加热1—2分钟，观察现象。
（3）黄色反应：
５、实验结果
（１）双缩脲反应：试管１——溶液变为淡蓝色；试管２——溶液变为淡蓝紫色。
（２）茚三酮反应：试管１——溶液变为淡蓝色；试管２——溶液变为淡蓝色，试管３――溶液变为蓝紫色。
（３）黄色反应：试管１――出现白色沉淀；试管２－－出现黄色沉淀；试管３――无明显现象；试管４――溶液变为黄色。
［参考文献］
王秀奇、秦淑媛、高天慧、颜卉君主编，《基础生物化学实验》，高等教育出版社，２００６年，Ｐ１２５－１３０，Ｐ１４６－１４８。
刑其毅等主编，《基础有机化学》第三版下册，北京高等教育出版社，2005年，Ｐ 983。
杨荣武主编，《生物化学原理》，北京高等教育出版社，２００４年，Ｐ10。