3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较
蛋白质含量测定方法及其比较资料2
蛋白质含量测定法（一）蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比B iuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100μg 快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高≈5μg慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5μg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其λmax由465nm变为强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同595nm 蛋白质变化值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较
原理：白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（O.D280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
3．实验设备及材料
（1）双缩脲法
实验器材：
①容量瓶②试管、试管架
③恒温水浴槽④吸量管
⑤分光光度计⑥电热套
⑦锥形瓶⑧比色皿
实验试剂：
一．实பைடு நூலகம்设计方案
③蛋白质样品或蛋白质样品溶液。
(2)考马斯亮蓝染色法
试剂:
①考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
②标准蛋白质溶液:牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9％NaCl准确配制。
1．实验目的：
⑴掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
⑵掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
⑶掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法。
⑷比较三种定量测定方法的异同。
2．实验原理、实验流程或装置示意图
（1）双缩脲法(Biuret法)测定蛋白质浓度
原理：在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与Cu2+作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝染色法
标准曲线的制作
1取12支试管，按下表加入试剂
2混匀，室温静置３min，以第１管为空白，于波长595nm处比色，测定OD值，
大鼠肝微粒体法评价20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用
大鼠肝微粒体法评价20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用张远冬1，刘学庆1，郭延垒2，张有金2，石亮2，王二豪2，于超 2（400016重庆，重庆医科大学：公共卫生学院生殖生物学研究室1，生命科学研究院2）[摘要]目的建立体外大鼠肝微粒体中CYP2C9酶活性测定方法，并以此方法评价20种中药有效成分单体对大鼠CYP2C9酶的作用。
方法以双氯芬酸（Diclofenac）为探针，在实验组大鼠肝微粒体孵育体系中加入20种中药有效成分单体，在37 ℃水浴温孵15 min后冰乙腈终止反应，HPLC测定各孵育体系中探针药物的代谢产物4＇-羟基双氯芬酸的转化率，并与对照组比较其差异来评价各有效成分对CYP2C9酶活性的作用。
结果4＇-羟基双氯芬酸、双氯芬酸及其内标香豆素三者分离良好且无其他内源性物质干扰；动力学考察表明双氯芬酸在0.25 mg/mL的大鼠肝微粒体体系中孵育15 min，测得酶动力学参数V max为0.1456 nmol/(min·mg)，K m为8.270 μmol/L；抑制实验考察发现：黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇实验组中4＇-羟基双氯芬酸转化率分别为（402.60±10.58）、（210.90±10.26）、（414.46±10.32）、（509.83±26.45）、（355.44±15.87）、（387.34±22.16）pmol/(min·mg)，显著低于对照组[（735.80±17.27）pmol/(min·mg)，P＜0.05]，其他中药成分实验组与对照组比较，其转化率无统计学差异。
结论建立了中药有效成分对CYP2C9酶作用的体外大鼠肝微粒体研究方法，并初步评价了黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇对CYP2C9具有抑制作用，在临床联合用药中需注意其可能引起的药物-药物相互作用。
最新[医学]Western blot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验-药学医学精品资料
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蛋白含量的测定及上样量的计算 考马斯亮蓝法（Bradford法）
H+
考马斯亮蓝G-250 + 蛋白质
蓝色
595nm
14
操作：
蒸馏水(ml)
空白管 标准管 测定管 0.05
标准蛋白液(ml)
0.05
样品(ml)
(适当稀释)
显色剂(ml)
(5倍稀释)
0.05 3.0 3.0 3.0
混匀，静置10min，于595nm处，以空白管 调零，测定各管吸光度
25
凝胶成分：
丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺 3M Tris缓冲液(pH=8.8) 2M Tris缓冲液(pH=6.8) N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 10%过硫酸铵(APS) 10%SDS ddH2O
26
装置：
27
SDS-PAGE电泳操作：
① 安装制胶装置，检查是否漏水 ② 配制10％分离胶（灌胶约2/3体积），蒸馏水液封 ③ 胶凝后倾去蒸馏水 ④ 配制4％堆积胶，灌满，插入梳子 ⑤ 胶凝后拔出梳子
40
▪ DAB显色操作：
按试剂盒说明配制显色剂
（按照1ml双蒸水中滴加A、B、C液各一滴的比例）
将NC膜置于配制好的显色液中
室温条件下显色约15分钟
（视显色的情况而定）
蒸馏水洗膜，并可进行结果的分析 41
结果分析
根据结合于膜上的预染Marker确定目的条带 可根据条带光密度扫描积分值进行定量分析 42
PP间期：并不绝对匀齐，但PP间期的互差<0.12 秒。
心房频率：60～100次/分。小儿不超过正常相应 年龄组心率95％或不低于正常相应年龄组的5％。
窦性心动过缓诊断要点
大鼠肝微粒体的制备教学文稿
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法学研究
大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法学研究朱曼;王睿;张永青;梁蓓蓓【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》【年(卷),期】2004(9)5【摘要】目的 :建立大鼠肝微粒体蛋白含量以及肝微粒体细胞色素P4 5 0酶系含量与活性测定的紫外和荧光分光光度方法。
方法 :应用差速离心法提取大鼠肝微粒体 ,Lowery法测定肝微粒体蛋白浓度 ,应用紫外和荧光分光光度法测定肝微粒体细胞色素P4 5 0酶系含量及活性。
结果 :牛血清白蛋白标准曲线的线性范围为 2 5～2 5 0mg·L-1,最低检测限为2 5mg·L-1,相关系数r为 0 .9975 ;紫外分光光度法测定细胞色素P4 5 0和细胞色素b5含量及NADPH CytC还原酶活性的结果显示方法灵敏 ;测定氨基比林N 脱甲基酶、红霉素N 脱甲基酶活性的甲醛标准曲线 ,线性范围为 0 .0 5～0 .5mmol·L-1,最低检测限为0 .0 5mmol·L-1,相关系数r为0 .9988;测定 7 乙氧基香豆素脱烃酶活性的resorufin标准曲线线性范围为 1～8μmol·L-1,最低检测限为1μmol·L-1,相关系数r为 0 .9998。
结论 :紫外和荧光分光光度方法测定大鼠肝微粒体细胞色素P4 5 0酶系中 6种酶的含量及活性的灵敏可靠 ,重复性较好。
【总页数】4页(P500-503)【关键词】紫外分光光度计;荧光分光光度计;肝微粒体细胞色素P450【作者】朱曼;王睿;张永青;梁蓓蓓【作者单位】解放军总医院临床药理药学研究室【正文语种】中文【中图分类】R965.2【相关文献】1.联合诱导法对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响 [J], 汪希兰;谢金才;王翠芬;2.氟喹诺酮类药物对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响 [J], 张沂;于春令;邸秀珍;赵猛;米媛媛3.甲磺酸加替沙星对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响 [J], 张沂;邸秀珍;任婷麟;王大鹏4.联合诱导法对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响 [J], 汪希兰;谢金才;王翠芬5.凹土玉米芯垫料对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系的影响 [J], 舒畅;张延英;吴建军;陶维天;蔺兴遥;朱建坤;康万荣;李存祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢邓少东;王颖;赵文昌;肖凤霞;林靖然;段倩倩【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2017(039)005【摘要】目的测定大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的含有量,并考察其在不同时间点(0、20、40、60、80、100、120 min)的代谢情况.方法 UPLC分析采用Waters BEH C1s色谱柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm);流动相甲醇-0.1％醋酸,梯度洗脱;体积流量0.5 mL/min;柱温30℃;检测波长338 nm.结果野漆树苷和芹菜素分别在3.714 ～37.143μg/mL(r=0.999 0)和3.729～37.286 μg/mL(r=0.999 6)范围内线性关系良好,方法回收率(RSD)分别为89.44％～ 93.75％ (0.78％～1.59％)和88.06％～93.98％ (0.91％～2.14％).两者在体外肝微粒体孵育体系的Ⅰ相代谢均呈线性消除,其中芹菜素更为显著.结论该方法简单、快速、可靠,可用于测定大鼠肝微粒体孵育体系中野漆树苷和芹菜素的含有量和代谢情况.【总页数】4页(P1002-1005)【作者】邓少东;王颖;赵文昌;肖凤霞;林靖然;段倩倩【作者单位】广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东东莞523808;广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东东莞523808;广东医科大学药学院,广东东莞523808;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学中药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】R284.1【相关文献】1.三物黄芩汤组分(群)配伍在大鼠肝微粒体孵育模型中的相互作用 [J], 周杰;商雪莹;杜慧琴;卢丽萍;张蕾2.LC-MS/MS定量测定大鼠和人肝微粒体孵育液中丁苯酞浓度方法的建立 [J], 赵芊;李燕;江骥;胡蓓3.大黄5种蒽醌类成分在大鼠肝微粒体中的代谢及酶促反应动力学 [J], 冯素香;王蒙蒙;吴兆宇;李先;郝蕊;徐艳华4.肝微粒体孵育体系中大黄酸及其代谢活化产物的检测方法研究 [J], 李恩泽;袁媛;邵华5.东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物分析及其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响 [J], 杨增艳; 张颖; 李嘉; 陈少锋; 黄鑫; 靳洪涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
注射用苯巴比妥钠
小鼠肌内注射苯巴比妥钠引起局部皮肤改变的护理对比观察摘要：观察肌内注射苯巴比妥钠引起小鼠局部皮肤改变的疗效与护理。
方法：将小鼠随机分为两组，对照组采用50% 的硫酸镁湿热敷；观察组肌内注射苯巴比妥钠，当发现局部皮肤有改变时，用统计学处理疗效对照得出结论。
关键词：苯巴比妥钠；局部皮肤改变；护理苯巴比妥钠是一种镇静催眠抗惊厥药物。
临床上，常用苯巴比妥钠治疗新生儿脑病、新生儿颅内出血、新生儿高胆红素血症等疾病，以防治惊厥的发生，降低耗氧，保护脑细胞。
在使用苯巴比妥钠特别是首次使用时，常采用肌内注射，以尽快达到治疗目的。
而新生儿皮肤娇嫩，脂肪组织比肌肉组织多，体温调节中枢发育不完善，皮肤温度易受外界温度影响。
如果注射过浅，药物在脂肪层内，不但药物吸收差，还会引起注射部位局部皮肤改变。
如处理得当、及时，可以防止发生坏死。
一、苯巴比妥钠目前的主要研究方向目前常见的苯巴比妥钠研究多为对新生儿脑的影响与保护或对惊厥的影响、对肝的微粒酶影响。
张素培研究了苯巴比妥干预对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护及对脑组织中的影响，并对苯巴比妥的脑损伤保护作用机制进行了初步探讨。
凡守金等人通过研究通过腹腔注射苯巴比妥钠溶液建立惊厥保护模型，检测腹腔注射硝酸士的宁后，苯巴比妥钠的保护作用是否存在，以探讨苯巴比妥钠保护作用的调控机制，为临床对抗药物惊厥提供有效实用的药物，并为苯巴比妥钠保护士的宁所致惊厥提供了理论和实验基础。
高梅等人通过用苯巴比妥钠比较4种方法诱导制备的大鼠肝微粒体酶(S9)的蛋白含量及活化效果，来探讨有效的肝微粒体酶诱导方法。
得出以多氯联苯、苯巴比妥联合β-萘黄酮、注射用苯巴比妥钠联合β-萘黄酮作为诱导剂可以成功制备大鼠肝S9，并具有较好的活性，联合诱导法可替代多氯联苯诱导法。
二、小鼠肌内注射苯巴比妥钠的反应研究。
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万方数据
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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较
作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院)
刊名：
中国药师
英文刊名：CHINA PHARMACIST
年，卷(期)：2011,14(3)
1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03)
2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01)
3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04)
4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01)
5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24)
1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4)
本文链接：/Periodical_zgys201103012.aspx。