大鼠肝微粒体酶活性的保存低温和冷冻干燥的影响
离体大鼠肝脏灌流法制备氯吡格雷活性巯基代谢物
China Pharmacy2022V ol.33No.14中国药房2022年第33卷第14期氯吡格雷活性巯基代谢物（clopidogrel active thiol metabolite，CATM，化学结构式见图1）是氯吡格雷发挥抗血小板疗效的最终活性物质[1]。
CATM化学结构复杂，C3—C16双键和C4位手性结构使其具有4种构型，分别为H1（7S，3E，4S）、H2（7S，3E，4R）、H3（7S，3Z，4S）、H4（7S，3Z，4R），其中H1和H2为反式CATM、H3和H4为顺式CATM[1]。
已有研究表明，人体内CATM的构型为顺式构型[2]。
目前市面上仅有反式CATM异构体H1、H2的标准品，使CATM的体内研究受限。
对CATM进行合成的现有技术中，常用的方法有化学合成法和生物酶肝微粒体催化法，其中化学合成法需要对C3—C16双键构型和C4位手性构型进行选择，步骤复杂[3]；生物酶肝微粒体催化法具有较高的生物选择性和转化效率，但肝微粒体成本高，酶催化反应条件严苛，同时因底物量受限难以得到足够的目标代谢产物[2]。
已有研究显示，离体大鼠肝脏灌流法被广泛用于大鼠肝脏的生理、病理生理、肝损伤及药物代谢研究，兼具体外实验和整体动物实验的优点[4－6]。
本实验拟采用（S）-2-氧氯吡格雷为底物，采用离体大鼠肝脏灌流法通过代谢途径制备CATM，旨在为顺式CATM的合成提供参考。
Cl43167NHSO OHOOC图1CATM化学结构式离体大鼠肝脏灌流法制备氯吡格雷活性巯基代谢物Δ刘艺＊，陶婷，刘云，李艳丽，胡盼盼，姜艳娇，孙增先#（徐州医科大学附属连云港医院/连云港市第一人民医院药学部，江苏连云港222002）中图分类号R914；R969.1文献标志码A文章编号1001-0408（2022）14-1724-06DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2022.14.11摘要目的建立氯吡格雷活性巯基代谢物（CATM）的制备方法，为顺式CATM的合成提供参考。
实验七探究影响酶活性的因素
实验七探究影响酶活性的因素一、实验目的：1．探究不同温度和PH对酶活性的影响；2．培养实验设计能力。
二、探究温度对酶活性的影响（一）实验原理：1．淀粉遇碘后，形成紫蓝色的复合物。
2．淀粉酶可以使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。
注：市售a-淀粉酶的最适温度约600C（二）方法步骤：1、取3支试管，编上号（A、B、C），然后分别注入2mL可溶性淀粉溶液；2、另取3支试管，编上号（a、b、c），然后分别注入1mL新鲜淀粉酶溶液；3、将装有淀粉溶液和酶溶液的试管分成3组，分别放入热水（约600C）、沸水和冰块中，维持各自的温度5min；思考题1、不能只用不同温度处理淀粉溶液或酶溶液，这是为什么？4、分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自的温度5min；5、在3支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀后观察这3支试管中溶液颜色变化并记录；思考题2、在试管A、B、C中分别能观察到什么现象？思考题3、通过上述实验，你能得出什么结论？思考题4、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？三、探究PH值对酶活性的影响（一）实验原理：思考题5、请依据下面所列实验操作步骤，写出该实验的实验原理。
思考题6、请在上表中填入你所观察到的实验现象。
思考题7、通过上述实验，你能得出什么结论？思考题8、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？思考题9、探究温度对酶活性的影响实验中是否可以用斐林试剂来检验实验结果？为什么？探究影响酶活性的因素四、与酶有关的曲线解读（一）表示酶高效性的曲线：1、催化剂可 化学反应速率，与无机催化剂相比，酶的催化效率更 。
2、酶只能 达到化学平衡所需时间，不改变化学反应的 。
3、酶只能催化 的化学反应。
（二）表示酶专一性的曲线：1、在A 反应物中加入酶A ，反应速率较未加酶时明显 ，说明酶A 催化底物A 参加反应。
2、在A 反应物中加入酶B ，反应速率和未加酶时 ，说明酶B 不催化底物A 参加反应。
西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响
西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响鲍珍贝;杨青;胡敏;童静玲【摘要】Objective To study the influence of total saponins from Panax quinquefolium Linne on the activity of CYP1A2 in rats.Methods Rats were randomly divided into control group,total saponins from Panax quinquefolium Linne groups [50,100 and 200 mg/(kg·d)] and positive control group.After pretreatment for 11 consecutive days,theactivity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 were measured.The pharmacokinetic changes of phenacetin (probe substrate of CYP1A2) in pretreatment rats were investigated.Results After pretreatment with total saponins from Panax quinquefolium Linne,the activity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 in rats were improved with dose increasing.The metabolic rate of phenacetin was speededup.Conclusion Total saponins from Panax quinquefolium Linne might induce the activity of CYP1A2.%目的考察西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响.方法将大鼠随机分为空白对照组(空白组)、西洋参总皂苷低剂量组[低剂量组,50 mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷中剂量组[中剂量组,100mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷高剂量组[高剂量组,200 mg/(kg·d)]和β-萘黄酮阳性药对照组[阳性药组,80 mg/(kg·d)],预处理11 d后,观察大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表达和CYP1A2酶蛋白表达情况,研究CYP1A2特异性探针底物非那西丁在预处理大鼠体内的药动学变化.结果预处理后,大鼠肝微粒体CYP1A2活性、mRNA和蛋白表达随西洋参总皂苷剂量升高有增加趋势,非那西丁在预处理大鼠体内代谢速率加快.结论西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性有一定诱导作用.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2017(000)003【总页数】4页(P250-253)【关键词】西洋参总皂苷;大鼠;肝微粒体;CYP1A2;非那西丁【作者】鲍珍贝;杨青;胡敏;童静玲【作者单位】台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院,浙江台州 318050;台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院,浙江台州 318050;台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院,浙江台州 318050;台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院,浙江台州 318050【正文语种】中文西洋参为五加科植物西洋参(Panax quinquefolium Linne)的干燥根，性凉，味甘微苦，归心、肺、肾三经[1-2]。
药物代谢动物实验基本操作注意事项
动物实验的基本操作
订实验动物 一般计划要做药理实验后，先订动物，饲养中心送动物 过来需要时间，如果动物供应紧张的时候，很可能等的
粪便温孵法 肠菌酶法
单一菌种温孵法
肝微粒体的制备
差速离心法
通过高速离心 使微粒体与其他成 分分离，操作简单， 无需其他试剂辅助， 但需要的时间长， 对设备的整体要求 高。
CaCl2沉淀法 制备肝微粒体， 即在离心前额外加入 CaCl2 ， 促 进 微 粒 体 的聚集和沉降。这种 方法对设备要求降低， 而且缩短了实验所需 的时间，是研究药物 体外代谢，制备微粒 体的常用方法。
药物代谢-生物转化
一相代谢
氧化，还原，水解反应； CYP450酶
二相代谢
内源性物质结合反应； UGTs，SULTs, NAT, GST, MT
药物代谢研究方法
体内代谢法 综合地考虑各种体内 因素对药物的影响,能 够真实全面地反映药 物代谢的体内整体特 征 药物在生物体内的分 布比较广，加上代谢 转化的器官和酶系的 多样性，使药物及其 代谢产物在体内的浓 度低，代谢产物的检 测具有一定的难度
要从尾部下四分之一处进针,血管表浅,好扎,而且如果 万一没打进,还可以向上找位置再打
进针后, 有没有回血很重要,回血肯定扎进了,如果没 有自动回血的话,轻轻回抽下,有回血的话就注射,扎进 血管,注射通畅,没有阻力。如果很难推进，一般是没 扎进，就不要再推了，打到组织里面会水肿，然后整 个血管就看不清了，无法注射。自己觉得没回血最好 别注射，换位置，一般是没进。 注射完毕一定要止血，不然药物可能随血流出来，给 药量不准了。
生化药物制造工艺酶类药物
生物材料的预处理
二、酶类药物的提取和纯化
动物材料的预处理 机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，因此须采用特殊的匀浆才行。
一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进行剧烈处理。
01
工业上可用高压匀浆泵。
在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。
02
由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。
（2）反复冻融
丙酮粉 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低温下可保存数年。 微生物的预处理 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。
1
2
3
结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。
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时间。 结晶形成的时间长短不一，从数小时到几个月都有，有的甚至需要1年或更长时间。
pH。除沉淀一般选择在被结晶酶的等电点附近。
金属离子。许多金属离子能引起或有助于酶的结晶，在二价金属离子存在情况下，有促进结晶长大作用。
盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种酶沉淀。
3、盐析法
2、酶液的脱色
工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为0．1％～1．5％。 目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种脱色树脂，效果都较好。
4、有机溶剂法
用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。
大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响
大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响吴双;李登科;李凯明;周明;孙震晓【摘要】目的:研究大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响.方法:利用大鼠肝微粒体对何首乌水提物进行体外代谢;将经代谢前后的何首乌水提物溶液冷冻干燥,以不同浓度(相当于生药1.5、3、6、12 mg/mL)分别作用肝L02及HepG2细胞24h及48 h,MTT法检测其对两种细胞活力的影响;HPLC测定何首乌水提物溶液中3种主要成分(二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黄素)的含量变化.结果:何首乌水提物代谢后,随着其剂量的增加,对细胞活力的抑制作用逐渐增强,与何首乌水提物未代谢组相比,浓度为12 mg/mL的何首乌水提物代谢组毒性明显降低(P＜0.01).HPLC测定结果显示,何首乌水提物代谢组上述3种主要成分含量均有所降低.结论:何首乌水提物经大鼠肝微粒体代谢后对肝细胞毒性降低,与其主要成分含量降低之间的关系需要进一步研究.%OBJECTIVE:To study the hepatotoxicity of aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix with or without incubation with the rat liver microsome.METHODS:Aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix was incubated with or without rat liver microsome in vitro and then dried by freeze drying.Liver L02 and HepG2 cells were incubated with different concentrations of the freeze-dried extract (1.5,3,6,12 mg/mL) for 24 h,48 h.Cell vitability was assayed by MTT method.In addition,contents of three main components (trans-2,3,5,4'-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucopyranoside,emodin-8-O-β-glucopy-ranoside,emodin) from aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix after incubation were quantitated by HPLC analysis.RESULTS:The aqueous extract without incubation with rat liver microsome showed more toxicityat the concentration of 12 mg/mL than that with incubation (P＜0.01).Contents of the three main components of aqueous extract incubated with rat liver microsome were lower than those without rat liver microsome.CONCLUSION:Hepatotoxicity of aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix was decreased after their metabolism by rat liver microsome.The relationship between reduced contents of the main components of the aqueous extract and the reduction of hepatotoxicity need further study for clarification.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2017(029)006【总页数】4页(P450-453)【关键词】何首乌;水提物;肝微粒体;肝细胞毒性;代谢【作者】吴双;李登科;李凯明;周明;孙震晓【作者单位】北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102【正文语种】中文【中图分类】R285.5中药何首乌(P olygoniMultifloriRadix)是蓼科植物何首乌(P olygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，入药始载于“日华子本草”，有解毒、消痈、截疟、润肠通便之功效 [1]。
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
执业药师之西药学专业一考试考点题型与解题方法
执业药师之西药学专业一考试考点题型与解题方法1、红外光谱特征参数归属羰基A.3750～3000cm-1B.1900～1650cm-1C.1900～1650cm-1;l300～1000cm-1D.3750～3000cm-1;l300～l000cm-1E.3300～3000cm-1;l675～1500cm-1;1000～650cm-1正确答案：B2、氟伐他汀含有的骨架结构是A.六氢萘环B.吲哚环C.吡咯环D.嘧啶环E.吡啶环正确答案：B3、药剂学的主要研究内容不包括A.新辅料的研究与开发B.制剂新机械和新设备的研究与开发C.新药申报法规及药学信息学的研究D.新剂型的研究与开发E.新技术的研究与开发正确答案：C4、以下关于栓剂附加剂的说法不正确的是A.叔丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对甲酚(BHT)可作为栓剂的抗氧剂B.当栓剂中含有植物浸膏或水性溶液时，可使用防腐剂及抑菌剂，如羟苯酯类C.栓剂可选用脂溶性着色剂，也可选用水溶性着色剂D.常用作栓剂增稠剂的物质有氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、没食子酸酯类E.起全身治疗作用的栓剂，为增加全身吸收，可加入吸收促进剂正确答案：D5、6α，9α位双氟取代的药物是A.醋酸氢化可的松B.醋酸地塞米松C.醋酸泼尼松龙D.醋酸氟轻松E.醋酸曲安奈德正确答案：D6、药物在一定比例混合溶剂中溶解度大于在单一溶剂中溶解度的现象称为A.絮凝B.增溶?C.助溶D.潜溶?E.盐析正确答案：D7、制备水不溶性滴丸时用的冷凝液A.PEG6000B.水C.液状石蜡D.硬脂酸E.石油醚正确答案：B8、以上辅料中，属于缓（控）释制剂溶蚀骨架材料的是A.乙基纤维素B.蜂蜡C.微晶纤维素D.羟丙甲纤维素E.硬脂酸镁正确答案：B9、下列属于阳离子型表面活性剂的是A.卵磷脂B.苯扎溴铵C.吐温80D.十二烷基苯磺酸钠E.泊洛沙姆正确答案：B10、大于7μm的微粒可被摄取进入（）（）A.肝脏B.脾脏C.肺E.骨髓正确答案：C11、（2019年真题）阿司匹林遇湿气即缓慢水解，《中国药典》规定其游离水杨酸的允许限度是0.1%，适宜的包装与贮存条件规定（ ）。