(仅供参考)实验4-肝微粒体制备
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
(仅供参考)药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
P450酶
• 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素P450(Cytochrome P450)氧化酶， 简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中， 是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。
P450酶氧化药物的过程谢源自大家或由还原辅酶Ⅰ供给，NADH-细胞色素b5还原酶传递，激活分子氧成 两个离子氧。 • 氧化：一个离子氧使药物氧化，另一个与氢结合成水。同时，P450Fe2+失去一个电子，而氧化再生成P450- Fe3+ 。因此可被反复利用用而 起催化作用。
药物与P450酶的关系
• 酶的底物（substrates ）：由P450酶代谢 • 酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或
抑制率 %
90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00
0.00
CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4 表型
代谢产物的鉴定
• 采用代谢稳定性一致的孵育体系，通过加一定浓度的药物孵育一定时 间，没有加药物的孵育体系作为空白对照进液质分析，分析鉴定代谢 产物。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
结果计算
大鼠肝微粒体法评价20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用
大鼠肝微粒体法评价20种中药有效成分对CYP2C9酶的作用张远冬1，刘学庆1，郭延垒2，张有金2，石亮2，王二豪2，于超 2（400016重庆，重庆医科大学：公共卫生学院生殖生物学研究室1，生命科学研究院2）[摘要]目的建立体外大鼠肝微粒体中CYP2C9酶活性测定方法，并以此方法评价20种中药有效成分单体对大鼠CYP2C9酶的作用。
方法以双氯芬酸（Diclofenac）为探针，在实验组大鼠肝微粒体孵育体系中加入20种中药有效成分单体，在37 ℃水浴温孵15 min后冰乙腈终止反应，HPLC测定各孵育体系中探针药物的代谢产物4＇-羟基双氯芬酸的转化率，并与对照组比较其差异来评价各有效成分对CYP2C9酶活性的作用。
结果4＇-羟基双氯芬酸、双氯芬酸及其内标香豆素三者分离良好且无其他内源性物质干扰；动力学考察表明双氯芬酸在0.25 mg/mL的大鼠肝微粒体体系中孵育15 min，测得酶动力学参数V max为0.1456 nmol/(min·mg)，K m为8.270 μmol/L；抑制实验考察发现：黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇实验组中4＇-羟基双氯芬酸转化率分别为（402.60±10.58）、（210.90±10.26）、（414.46±10.32）、（509.83±26.45）、（355.44±15.87）、（387.34±22.16）pmol/(min·mg)，显著低于对照组[（735.80±17.27）pmol/(min·mg)，P＜0.05]，其他中药成分实验组与对照组比较，其转化率无统计学差异。
结论建立了中药有效成分对CYP2C9酶作用的体外大鼠肝微粒体研究方法，并初步评价了黄芩素、蛇床子素、大黄素、獐牙菜苦苷、淫羊藿苷、白藜芦醇对CYP2C9具有抑制作用，在临床联合用药中需注意其可能引起的药物-药物相互作用。
药物代谢动物实验基本操作注意事项
动物实验的基本操作
订实验动物 一般计划要做药理实验后，先订动物，饲养中心送动物 过来需要时间，如果动物供应紧张的时候，很可能等的
粪便温孵法 肠菌酶法
单一菌种温孵法
肝微粒体的制备
差速离心法
通过高速离心 使微粒体与其他成 分分离，操作简单， 无需其他试剂辅助， 但需要的时间长， 对设备的整体要求 高。
CaCl2沉淀法 制备肝微粒体， 即在离心前额外加入 CaCl2 ， 促 进 微 粒 体 的聚集和沉降。这种 方法对设备要求降低， 而且缩短了实验所需 的时间，是研究药物 体外代谢，制备微粒 体的常用方法。
药物代谢-生物转化
一相代谢
氧化，还原，水解反应； CYP450酶
二相代谢
内源性物质结合反应； UGTs，SULTs, NAT, GST, MT
药物代谢研究方法
体内代谢法 综合地考虑各种体内 因素对药物的影响,能 够真实全面地反映药 物代谢的体内整体特 征 药物在生物体内的分 布比较广，加上代谢 转化的器官和酶系的 多样性，使药物及其 代谢产物在体内的浓 度低，代谢产物的检 测具有一定的难度
要从尾部下四分之一处进针,血管表浅,好扎,而且如果 万一没打进,还可以向上找位置再打
进针后, 有没有回血很重要,回血肯定扎进了,如果没 有自动回血的话,轻轻回抽下,有回血的话就注射,扎进 血管,注射通畅,没有阻力。如果很难推进，一般是没 扎进，就不要再推了，打到组织里面会水肿，然后整 个血管就看不清了，无法注射。自己觉得没回血最好 别注射，换位置，一般是没进。 注射完毕一定要止血，不然药物可能随血流出来，给 药量不准了。
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，其具有多种生物合成和代谢功能。
为了研究肝微粒体的结构和功能，科学家们开展了一系列的制备方法。
肝微粒体的制备方法主要包括离心法、差速离心法和梯度离心法。
离心法是最常用的制备方法之一。
首先需要从动物或人体中提取肝脏组织，然后将组织切碎并加入缓冲液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过不同离心速度和离心时间的调节，可以分离出肝微粒体。
差速离心法是离心法的一种改进方法。
该方法利用不同细胞器的密度差异，通过多次离心来进一步分离纯净的肝微粒体。
首先，将组织切碎并加入缓冲液进行离心，得到一个粗制的肝微粒体上清液。
然后，将上清液进行再离心，获得更纯净的肝微粒体。
通过多次离心，可以得到更高纯度的微粒体。
梯度离心法是一种更为精细的制备方法。
该方法利用不同密度的梯度溶液，通过离心使得细胞器分层。
首先，制备不同浓度的梯度溶液，然后将组织切碎并加入梯度溶液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过调节离心速度和时间，可以分离出纯净的肝微粒体。
肝微粒体的制备方法选择取决于研究的目的和需要。
离心法简单易行，适用于初步的制备。
差速离心法和梯度离心法需要更多的技术和设备支持，但可以得到更高纯度的肝微粒体。
在肝微粒体的制备过程中，需要注意以下几点。
首先，组织的采集和处理需要在低温和无氧条件下进行，以保持微粒体的完整性和活性。
其次，离心速度和时间的选择应根据具体实验要求进行调整，以获得最佳的分离效果。
此外，在制备过程中，需要注意避免污染和交叉感染，以确保实验结果的准确性和可靠性。
肝微粒体的制备是研究肝细胞生物学和代谢过程的重要工具。
离心法、差速离心法和梯度离心法是常用的制备方法，选择适合的方法可以得到纯净的肝微粒体。
在实验过程中，需要注意操作技巧和实验条件的控制，以确保制备的微粒体质量和纯度。
通过这些制备方法，科学家们可以更深入地研究肝微粒体的结构和功能，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
肝损伤实验报告（论文资料）
急性肝损伤对药物作用的影响【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。
2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。
3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。
4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。
【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。
【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。
【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。
【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。
2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。
1、CCl4肝损伤动物模型的制作：模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。
饲养过夜。
2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响：24h后，取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。
观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。
3、肝脏大体病理形态观察：入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。
4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。
5、血清ALT测定：ALT活性计算公式：C样=（A样/A标）× C标C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值， C标为100 U/L【结果】1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s表示，做组间t检验）实验组别地西泮入睡时间（S）生理盐水组215.40±70.47CCl4肝损伤组59.35±14.89t检验过程:（1）建立检验假设，确定检验标准H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同ɑ=0.05（2）计算检验统计量由原始数据计算得：n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35运用统计学公式计算得：S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19S¯x1-¯x2=16.5233算得t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444(3)确定P值，作出推断结论V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712,本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。
体外肝代谢系统
体外肝代谢系统【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。
对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。
对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。
本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。
【关键词】细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢一般是指药物的生物转化。
药物经生物转化后，可引起药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。
因此，研究药物的生物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。
肝脏是药物生物转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的酶系组成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。
本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶，为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础。
动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。
以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。
1肝微粒体肝微粒体的制备多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分分离，操作简单，无需其他试剂辅助。
但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。
针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。
此法对设备要求降低，并缩短了实验周期。
肝微粒体的制备过程均应在4℃下进行。
正确、合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。
肝微粒体的主要应用测定CYP450酶活性测定原理是在特定酶催化下，底物在辅助因子以及适合的温度、时间作用下反应，借助仪器测定生成的特定产物量。
肝微粒体制备
肝微粒体制备1. 简介肝微粒体（mitochondria）是细胞中的一种细胞器，主要负责细胞内能量的产生和调节。
肝微粒体制备是一种常用的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
本文将介绍肝微粒体制备的步骤和相关实验方法。
2. 肝微粒体制备步骤2.1 器材准备•洗涤缓冲液：含有0.25 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA 和0.1% BSA的缓冲液。
•离心管：用于离心过程。
•显微镜滑片：用于观察制备得到的肝微粒体。
2.2 肝脏取材•将新鲜动物（如小鼠）的肝脏取出，并放入冰冻盒中保持低温。
•快速切碎肝脏组织，以避免氧化酶的活性降低。
2.3 组织匀浆•将切碎后的肝脏组织加入洗涤缓冲液中。
•使用均质机将组织匀浆，以破碎细胞膜和释放肝微粒体。
2.4 离心分离•将匀浆后的混合液离心10分钟，以去除未破碎的细胞碎片和细胞核。
•将上清液转移到新的离心管中，并进行第二次离心，以沉淀肝微粒体。
2.5 肝微粒体收集•将离心得到的沉淀用洗涤缓冲液悬浮。
•用洗涤缓冲液洗涤肝微粒体，以去除杂质。
•最后一次离心后，将上清液倒掉，保留沉淀中的肝微粒体。
3. 肝微粒体制备相关实验方法3.1 蛋白含量测定•使用Bradford方法或BCA方法测定制备得到的肝微粒体中蛋白质的含量。
•根据实验需要调整蛋白质的浓度。
3.2 肝微粒体功能检测•使用荧光探针（如JC-1）检测肝微粒体的膜电位。
•使用呼吸链底物（如琥珀酸、NADH）测定肝微粒体的呼吸功能。
3.3 肝微粒体结构观察•使用透射电子显微镜观察制备得到的肝微粒体的形态和结构。
•准备样品时要注意避免溶剂残留和样品的干燥。
4. 结论肝微粒体制备是一种重要的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
通过合理的步骤和实验方法，可以成功制备得到高质量的肝微粒体，并进一步开展相关实验研究。
了解肝微粒体的制备过程对于深入理解细胞内能量代谢和调节机制具有重要意义。
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6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。
8.离心25000g/min, 15min；
9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用.
注意事项：
上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的!
4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
5.取上清离心（12000g,10min）；
6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。
7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀；
三、实验步骤
1. 处死小鼠；
2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。
3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
4.取上清在更快速的100,000g离心旋转之 下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状， 而可溶性酶素则保留在上清中，将沉淀重 悬即可得到微粒体。因此微粒体在细胞生 物学中定义为从内质网的碎片所得到的小 型囊泡。
2. 体外试验 是指采用某种实验技术从动物机体分
离出肝脏或肝细胞的亚细胞结构，让其在 体外与肝毒物接触一定时间，然后进行各 种检测，如动物的离体肝灌流试验、肝细 胞原代培养与肝细胞毒性试验、肝匀浆毒 物代谢试验等。
一、本次实验的目的和原理
1.微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程 中获得的由破碎的内质网自我融合形成的 近似球形的膜囊泡状结构，包含内质网膜 和核糖体两种基本成分，在体外实验中具 有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成 等内质网的基本功能。
二、实验仪器及药品
1. 器材： 电动匀浆机、漩涡混合器、高速冷冻离心机、
天平、解剖器械、烧杯、注射器、离心管 （15ml）、加样枪、枪头、滤纸等。 2. 试剂：
0.9%氯化钠溶液（每人50ml）； pH7.4的 蔗糖-Tris-盐酸缓冲液（每人5ml） ； pH7.4的氯 化钾-Tris-盐酸缓冲液；88mmol/L氯化钙溶 液； pH7.4的磷酸缓冲盐溶液。 3. 实验动物：成年小鼠
实验五 肝微粒体制备及相关酶活性测定
肝脏损伤的检测与评价
评价化学毒物引起肝损害的方法有两大类： 1. 体内实验（in vivo test） 即整体动物试验 2. 体外实验（in vitro test）
1. 体内试验 方法是将肝毒物给予受试动物，然后
处死动物或在动物存活的情况下进行各种 生物检测，如动物染毒后的血清酶学分析、 肝脏排泄与分泌功能测定、肝脏化学组成 分析以及肝脏损害的组织病理学检查等。