动物组织石蜡切片制作流程
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。
用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。
二、材料与用具1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。
2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
三、实验内容与步骤1．取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组织块。
用先用0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。
如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1，固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。
3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。
脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。
脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。
脱水所用的酒精浓度及过程如下：30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12 hr，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3 hr 左右。
做切片方法
常规组织病理技术切片技术是病理检验技术的重要组成部分。
在实验室内的病理检查工作中，不仅要观察大体标本的病理变化，更重要的还要观察组织标本的病理变化，才能作出最后诊断。
大体标本的病理变化是用肉眼观察，而组织标本必须借助显微镜进行观察。
组织标本的质量将直接影响镜检观察，也就是影响到诊断和研究。
学习和从事切片技术工作，首先应当认识这一工作的重要性，提高责任感。
切片技术随着生物学和医学的发展而发展，随着光学仪器和切片机的日益精密而不断改进。
下面仅就目前兽医实验室最常用的石蜡切片的制作技术做一系统的介绍。
（一）石蜡切片制作方法和程序任何组织制成一张菲薄的切片标本需要经过一系列的处理过程，而每一过程的步骤和手续严密而复杂。
现将制作石蜡切片的主要程序介绍如下。
制作石蜡切片的主要程序：取材；固定；脱水；透明；浸蜡；包埋；切片；染色；封固。
1.取材病理组织大多数采自动物尸体剖检材料或活体检查组织，取材的种类、数量取决于诊断和研究的目的，病理组织要越新鲜越好，因此标本取材后要及时切成小块，进行固定。
取材时必须注意：⑴接受病理组织材料时，必须依据送检单详细检查送检物。
自己采的病料也要求及时填写送检单。
检查时注意标本名称、数量与送检单是否相符，并查明送检单位地址以及有无临床及化验等有关资料。
如果发现送检标本不符，标本固定不当以及标本发生腐败等而不能制作切片时，应立即退回；若检查无误，应将标本及时登记、编号。
⑵组织切块需用锐刀或剪，切忌对组织材料挤压，揉搓及扭折等损伤，以保持组织完整及生活时状态。
⑶切块要选择病变显著部位及可疑病灶。
切取组织块要包括病灶及其周围健康部分，重要病变可多取几块，以反映病变各阶段、各部分的形态变化。
采取组织应包括各该器官的各组成部分，如肾脏应包括被膜、肾皮质部、肾髓质部、肾乳头及肾盂。
⑷组织块不宜过大，通常长1厘米，宽为1.5厘米，厚度为0.3厘米，最宽可达1.5~3厘米，但厚度不超过0.5厘米为宜。
动物组织切片的制作与染色
动物组织切片的制作与染色一、目的掌握动植物材料石蜡切片及染色的原理和技术。
二、原理石蜡切片（paraffin section）是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
石蜡切片制作基本过程包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。
一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
三、仪器与试剂（一）仪器组织切片机及配套刀片、摊片用水浴锅、恒温箱、电子天平、酒精灯、脱水篮、染色架等。
（二）试剂1. Bouin氏液苦味酸饱和水溶液75 mL甲醛25 mL冰醋酸 5 mL渗透速度快，对于小块组织只须固定数小时，组织收缩很少，着色良好，不使组织变硬和变脆。
固定后的组织可直接投入70%酒精脱水。
2. 70%、80%%、95%酒精及无水酒精：95%以下的各级浓度酒精是用95%酒精加蒸馏水稀释而成。
简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加蒸馏水至该酒精的原浓度即可。
例如，配制70%酒精，就量取70 ml95%酒精，然后加入25 ml蒸馏水即成。
3.蛋白甘油：蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。
配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。
4. Ehrilich氏酸性苏木素液苏木素 2 g纯酒精100 ml钾明矾15 g蒸馏水100 ml甘油100 ml冰醋酸10 ml将苏木素溶于纯酒精，再将钾明矾溶于蒸馏水中，溶解后将甘油倾人混合，然后加入苏木素酒精混合，最后加人冰醋酸，溶液全部混合后，应暴露在日光下使其自然成熟，时间约要三个月（若加人300毫克碘酸钠，使苏木素迅速氧化则可立即使用）。
第二讲 石蜡切片技术1：动物麻醉与取材
（16）神经 ）
部位：坐骨神经、股神经。 部位：坐骨神经、股神经。 方法：横切。 方法：横切。 注意：两端结扎固定，然后投入固定液中。 注意：两端结扎固定，然后投入固定液中。
（17）大脑 ）
部位：中央前回或后回。 部位：中央前回或后回。 方法：垂直切入。 方法：垂直切入。 注意：皮质、髓质均切到。 注意：皮质、髓质均切到。
（20）内耳 ）
动物：豚鼠等较小的动物。 动物：豚鼠等较小的动物。 方法：整体取材。 方法：整体取材。 注意： 先用注射法固定 ， 然后将内耳整体取下 并投 注意 ： 先用注射法固定， 然后将内耳整体取下并投 入固定液中继续固定。 此外， 需用火棉胶包埋切片。 入固定液中继续固定 。 此外 ， 需用火棉胶包埋切片 。
3．取材注意事项 ．
（1）动作轻柔，避免挤压组织。一般用刀片，少用 ）动作轻柔，避免挤压组织。一般用刀片， 或不用剪刀， 切取时要一刀下去， 或不用剪刀 ， 切取时要一刀下去 ， 不要来回拉锯式 拖动。 拖动。 内完成。 （2）及时取材。动物死后 ）及时取材。动物死后30min内完成。若制作电 内完成 镜标本，最好10min内完成。 内完成。 镜标本，最好 内完成 （ 3） 组织块大小适中 ， 一般为 ×1×0.3~0.5cm， ） 组织块大小适中， 一般为1× × ， 并有代表性。 并有代表性。 （4）取材后及时固定。 ）取材后及时固定。
十二 指肠、空肠、回肠
肠绒毛
大肠：肠腺、淋巴组织
（7）肾 ）
动物：较小者为好。 动物：较小者为好。 方法： 最好先进行灌注固定， 而后取材， 方法 ： 最好先进行灌注固定 ， 而后取材 ， 即从肾动 脉注入固定液， 同时切开肾静脉， 当血液流尽后， 脉注入固定液 ， 同时切开肾静脉 ， 当血液流尽后 ， 将全肾投入固定液中固定2~4h后，再沿正中矢面剖 将全肾投入固定液中固定 后 然后在任一半面上， 开 ， 然后在任一半面上 ， 从皮质向髓质的方向切一 扇形组织块， 以确保皮质、 髓质完全， 扇形组织块 ， 以确保皮质 、 髓质完全 ， 再投入固定 液继续固定。 液继续固定。 注意：皮质、髓质一定要完整。 注意：皮质、髓质一定要完整。
石蜡切片制作超详细步骤
石蜡切片制作超详细步骤1．取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。
注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜拖太久，以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定30－50min。
注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，用黑色铅笔写。
3.洗涤材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。
4.脱水材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象5．透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min （至透明为止）。
【大学实验】动物组织石蜡切片制作-PPT课件
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（二）石蜡切片制作
• 用切片机将石蜡包埋的组织块（蜡块）制成适宜厚度的切 片，是目前在病理学科中最常用的一种制片方法。切片厚 度为一般4~6μ m。 【切片前的准备】 1、修切蜡块 切片前应先修块，即切去组织周围过多的石 蜡，一般留下约2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留 得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则 影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却 一定时间。 2、切片用品准备 （1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一 次性切片。 （2）载物片：载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 （3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度。 （4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。
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方案一:病理石蜡切片的制作
（一）石蜡组织块制作 1．取材。 2．固定。 3．脱水、透明及浸蜡（具体步骤见表）。 4．包埋
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步骤 （1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9） （10） （11） （12）
操作项目 60%乙醇 70%乙醇 80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 无水乙醇Ⅰ 无水乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ
小鼠 15min 15min 20min 20min 20min 20min 20min 20min 5min 3min 10min 20min
大鼠 20min 20min 30min 30min 30min 20min 30min 30min 8min 5min 15min 25min
家兔 30min 30min 40min 40min 40min 30min 40min 40min 10min 5min 20min 30min
石蜡切片和免疫组化 步骤整理
一：步骤石蜡切片（骨组织）1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。
脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。
2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。
3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。
4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。
→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。
（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。
）5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。
6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。
在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。
）7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。
8：收片子，37℃保存。
HE染色1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）2：染色：苏木精-2-3min3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h4：伊红染色-2min4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。
用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。
二、材料与用具1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。
2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
三、实验内容与步骤1．取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组织块。
用先用0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。
如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1，固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。
3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。
脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。
脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。
脱水所用的酒精浓度及过程如下：30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12 hr，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3 hr 左右。