神经生物学常用的研究的方法共93页
神经生物学和神经科学的研究方法和应用
神经生物学和神经科学的研究方法和应用神经生物学和神经科学是两个密切相关的领域，它们都关注的是神经系统的结构和功能。
神经生物学主要研究神经细胞如何产生电活动、传输信息等基础生理学问题，而神经科学则更加综合，既涉及动物行为学、认知心理学等心理学方面的问题，也包括神经解剖学、生物化学等生物学方面的问题。
本文将主要从研究方法和应用两个方面入手，探讨神经生物学和神经科学的研究现状和未来发展趋势。
一、神经生物学的研究方法在神经生物学领域，科学家们使用的研究方法包括但不限于以下几种：1.神经记录技术：该技术可以记录神经元产生的电信号，通过测量电信号的强度和时序等参数，分析神经元的激动性和抑制性。
例如，著名的多电极阵列技术可以同时记录多个神经元的电信号，揭示神经元之间的相互作用。
2.神经成像技术：该技术可以通过光学或磁学方法成像神经元的活动。
如荧光成像技术用于实时观察神经元胞内钙离子浓度的变化；功能性磁共振成像技术可以在活体动物或人体中非侵入性地检测脑区活跃程度。
3.基因修饰技术：该技术可以在动物模型中特定地改变神经元的基因表达，进而研究基因对神经系统发育和功能的影响。
例如，利用转基因技术可以使小鼠产生类似于人类帕金森病的症状，从而研究该疾病的发病机制和治疗方法。
4.离体神经研究技术：该技术将神经元或神经组织从体外收集并进行实验，使研究人员可以更深入地探究神经元的生理和分子机制。
如单个神经元培养技术可以研究神经元的形态和功能发育；原代神经元培养技术可以用于研究神经细胞在疾病环境下的表达和适应。
二、神经科学的研究应用在神经科学领域，应用广泛，其中一些典型应用包括但不限于以下几个方向：1.神经疾病的研究和治疗：神经科学家们通过研究神经系统的功能和结构变化，探索各类神经疾病的原因，设计药物和治疗方案，例如阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中等常见神经疾病。
2.神经可塑性和学习记忆：神经科学家们研究神经元在学习和记忆形成过程中的变化和适应，揭示记忆在神经系统中的编码过程，发现神经可塑性的规律及其机制，为人工智能领域的发展提供了重要参考。
神经生物学研究常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
神经生物学的形态学研究方法
第一部分神经生物学的形态学研究方法一、研究神经细胞的形态及细胞构筑的方法（一）尼氏（Nissl）染色法原理用碱性染料染神经组织常用染料焦油紫、硫堇、中性红结果尼氏小体被染色，背景无色。
用途皮质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑（二）高尔基（Golgi）镀银染色法原理铬银与脂蛋白形成复合物，在细胞膜系统的间隙内形成结晶结果整个细胞为黑色用途显示整个细胞的全貌二、研究神经径路的方法（一）溃变法原理神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发生顺行变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继而呈颗粒状），可用镀银法显示或电镜观察。
胞体发生逆行变性（胞体内色质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的一边），可用尼氏法显示。
应用研究纤维联系。
（二）辣根过氧化物酶（HRP）标记法原理HRP注入神经组织或脏器—逆行、顺行、过节标记—H2O2、色原酶反应—呈色试剂HRP： 1.游离HRP2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP）色原： 1.二氨基联苯胺(DAB)2.二盐酸联苯胺(BDHC)3.邻-联茴香胺(OD)4.四甲基联苯胺(TMB)稳定剂:硝普钠、钨酸钠用途研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。
还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。
（三）荧光素轴突逆行传递标记法原理将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。
在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。
荧光素Furogold FB-NY GB-NY TB-Bb PI-Bb EB-DAPA应用研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。
（四）放射自显影示踪技术原理将放射性同位素3H等标记的氨基酸导入神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋白质，沿轴突顺行运输，分布于整轴突和末梢，同位素产生的核射线使照相乳胶感光，根据感光银粒所在部位和黑度判断放射性示踪剂的位置和数量，从而确定神经纤维的路径。
示踪剂3H -脯氨酸标记终末、跨突触标记3H -亮氨酸标记终末、纤维3H -HRP酶蛋白与HRP结合双标记用途研究神经元的传出路径（五）2-脱氧葡萄糖放射自显影法原理2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。
神经生物学方法
GFAP-ir
40X
P75-ir
40X
原位杂交(IN SITU HYBRIDIZATION)
原位核酸分子杂交技术（In situ nucleic acid molecular hybridization)简称原位杂交技术。是 用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测 组织细胞内待定核酸序列的方法。根据 所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可 分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNARNA杂交。
X40 NADPH-d Staining In Caudate Nucleus
NADPH
免疫组织化学 (Immunohistochemistry)
利用特异性抗体对神经组织中某种特异 成份(抗原)进行抗原--抗体反应,达到检 测组织细胞内是否有此特异性物质。其 本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定 组织细胞内的某种化学物质) 。
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
X40
Double-labelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
Immunohistochemical procedures
1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异 性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白 蛋白（BSA）封闭。 3.Incubate in primary antibody:最佳浓度 需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体 稀释液中加入0.1%～0.3%TritonX-100。需长 时间孵育时应加入0.01%～0.3%NaN3防腐。 产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。
神经科学的研究方法和技术
神经科学的研究方法和技术神经科学是一个十分复杂的研究领域，它主要关注于人类和动物神经系统的结构、功能和行为。
在这个领域，神经科学家开发了许多方法和技术来理解和研究神经系统的不同方面。
在本文中，我们将介绍一些常见的神经科学研究方法和技术。
1.立体显微镜技术人类大脑中不同区域的神经元数量可以达到数百万，而且这些神经元是高度重叠和交织的，因此，对神经元的细微结构和连接的研究需要高分辨率的成像技术。
立体显微镜技术是一种新兴的高分辨率神经元成像技术。
它允许神经科学家在不切割或注染样本的情况下对神经元进行高分辨率成像。
立体显微镜系统通常包括离子束或光线扫描仪和特殊软件，该软件可以将成像结果转换为三维模型。
这一技术的开发，使得神经科学家可以更加深入地研究神经元的结构和连接，从而更好地理解人类大脑的神经机制。
2.胶质细胞成像技术与神经元不同，胶质细胞对于大脑功能的研究却一直被忽视。
然而，最近的研究表明胶质细胞在神经系统中发挥着重要的作用。
胶质细胞是一种非神经元细胞，它们在神经系统中起到了许多重要的功能，比如维持神经元的健康状态，参与神经递质的清除和信号传导等。
胶质细胞成像技术是一种新兴的技术，可以对胶质细胞进行成像和监测。
这一技术包括荧光显微镜成像、原位钙成像和基因编辑技术等。
这些方法可以帮助神经科学家更好地理解胶质细胞在神经系统中的作用和功能。
3.脑成像技术脑成像技术是一种非侵入性的技术，可以在不进行手术等破坏性操作的情况下对大脑进行成像。
脑成像技术非常重要，因为它可以帮助神经科学家了解大脑各部位的功能和连接。
目前，一些常用的脑成像技术包括磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)和磁共振扫描(MRS)等。
这些技术可以帮助研究者更全面地了解大脑中神经元和神经网络的活动。
4. 细胞膜张力成像技术细胞膜张力在细胞和细胞之间的相互作用和通讯中起到了非常重要的作用。
然而，在神经细胞中描绘细胞膜的形态和性质是一项困难的任务。
神经生物学的常用研究方法
逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。
常用方法：
a 辣根过氧化物酶追踪法
1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取， 经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可 显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技 术，即HRP法。
呈色在剂的：情况下，1.二能氨使基DA联B苯发胺生(氧DA化B，): 生DA成B不作溶为性供棕氢褐体色，反H应RP产在物H沉2O淀2存， 定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)
用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组 织化学、电镜技术等结合。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
（1）轴浆运输追踪法
轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺 乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将 各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢 释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末 梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至 胞体。不同物质的运输速度不同。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度
高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。
神经生物学研究方法
组织培养：下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等
体 （胚胎、成年）
外
基因功能
实
原代细胞 细胞通路
验
细胞培养
膜片钳 肿瘤细胞系
细胞系
永生化细胞：P19
一、 组织培养：
下丘脑、垂体、海马、活体脑切片培养 等 （胚胎、成年）
Brain slice cultures
Both figures shows slice cultures of the cerebellum. Left picture: The typical cytoarchitectonic organization of the cerebellar cortex is maintained, and it is possible to nicely distinguish the molecular layer (ML) with the Purkinje cell dendrites (red), the Purkinje cell layer (PCL) with the Purkinje cell bodies (red) and the granule cell layer (GCL) with the granule cells. (green). Right picture: Besides the dendritic arbours, also the axonal projection of the Purkinje cells is present in the slice cultures.
电镜：观察细微结构和亚细胞机构
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双光子显微镜：观察活细胞
• 双光子荧光显微镜是结合激光扫描共聚焦 显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
神经生物学常用研究方法PPT课件
加尔（19世纪初 ）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑 的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理 论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表） 同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象 征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生 理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保 守的阐述之外，还兼论颅相学。
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Positron Emission Tomography (PET， 正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
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18F-FDG PET脑代谢显 像，正常人与老年性痴呆 对照，患者双侧顶叶、颞 叶皮质对称性低代谢。
18F-DOPA PET脑受体显像， 正常人与帕金森氏病脑纹状体 多巴胺受体密度影像对照，患 者双侧纹状体密度明显减少
MRI vs MEG
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Magnetic Resonance Imaging (MRI)
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fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity
Oxygen consumption
Cerebral blood flow