园艺植物生物技术

《园艺植物生物技术》实验教案实验一现代生物技术实验室与实验仪器一、实验目的实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。

华中农业大学国家农作物分子技术育种中心和国家柑橘育种中心的生物技术研究在国内一直处于领先地位并有重要国际知名度，其实验室布局和仪器配置能代表目前国内外生物技术实验室的整体情况，通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代生物技术实验室的认识。

二、实验场所选择及实验内容作物遗传改良国家重点实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的如高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法与步骤1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。

2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局，及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问四、实验注意事项实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。

五、思考题1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。

2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？《园艺植物生物技术》实验教案实验二植物组织培养一、实验目的植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。

胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。

二、实验原理基于1902年德国科学家哈勃兰特(HabrlMdt)提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。

在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。

三、主要仪器及试材仪器：PH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂四、实验方法与步骤1、培养基的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。

KNO395 gNH4NO382.5 gKH2PO48.5 gMgSO4•7H2O 18.5 gCaCl2•2H2O 22.0 g注意事项：1、配置母液前要仔细清洗存储容器2、应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；3、溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；4、夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；5、沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的（浑浊型沉淀），所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。

●微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：KI 0.083 gH3BO30.62 gZnSO4*7H2O 0.86 gNaMoO4*2H2O 0.025 gCuSO4*5H2O 0.0025 gCoCl2*6H2O 0.0025 gMnSO4*4H2O 2.23 g (MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。

配制过程中产生沉淀的原因有：1. 前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2. 蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。

●甘氨酸和肌醇的配制(100倍):甘氨酸: 0.2 g溶解定容到一升; 肌醇: 10 g溶解定容到一升。

●铁盐的配制（100倍）:称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

●维生素B的配制（100倍）：改良MT：VB1（盐酸硫氨素）1g, MS：10 mgVB6 (盐酸吡哆素) 1g, 50 mgVB5 (烟酸) 0.5g, 50 mg分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1升。

注: 需要溶解完一个再加另一个。

VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。

●Vc的配制（100倍）：称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1升即可。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。

这样不容易产生沉淀。

2、配好母液后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1升,调节pH 至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。

大量元素(10倍液) 100 ml微量元素母液的配制(100倍) 10 ml甘氨酸和肌醇的配制(100倍) 10 ml铁盐的配制（100倍） 10 ml维生素B的配制（100倍） 10 mlVc的配制（100倍） 10 ml蔗糖 20 g琼脂 7.5 g3、接种与培养，在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。

五、实验注意事项1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。

2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。

六、实验结果处理一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。

七、思考题影响植物组织培养的因素有哪些？主要参考文献1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。

胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立。

植物学通报, 2005，22:37-422.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。

实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）《园艺植物生物技术》实验教案实验三植物DNA的提取及电泳检测一、实验目的DNA 提取是开展分子生物学的重要前提之一，高质量的DNA直接关系到分子标记、基因克隆、图谱构建及功能基因组研究等工作的成败。

本实验旨在锻炼同学们DNA操作及检测的基本技能，为将来从事园艺植物生物技术研究奠定基础。

二、实验原理植物的遗传物质是DNA，植物细胞内含有丰富的遗传物质。

在机械研磨、高温和去污剂的共同作用下，植物细胞破裂，DNA从细胞核释放到提取缓冲液中。

经蛋白质强变性剂处理结合离心，除去蛋白质和色素等杂质，再用乙醇沉淀便可获得高纯度的DNA。

DNA电泳是依据DNA带负电荷，而不同浓度的琼脂糖凝胶孔径大小不同，在外加电场的作用下DNA由负极向正极移动，分子量小的移动快而分子量大的移动慢，最终达到不同分子量大小的DNA分离的目的。

三、主要仪器及试材水浴锅、离心机、电泳仪等新鲜健康柑橘叶片，液氮、及DNA提取有关试剂四、实验方法与步骤1. 药品的配制:CTAB提取液：(1) 100 mM Tris-HCl(PH 8.0),1.5 M NaCl,50 mM EDTA(PH 8.0)(2) 1% PVP，2% CTAB(3) 取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量,65℃水浴充分溶解备用。

使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇,混均匀。

苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）：重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。

2. DNA的粗提在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用尖头玻棒将材料研细后加入500 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后8000-10000 rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000 rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000 rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。

3. DNA的纯化：向风干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase,37℃水浴6小时，然后加入500 µl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，8000-10000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入500 µl氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），8000 –10000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 µl 5M NaCl，再加入1 ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡,2小时后换一次,后浸泡过夜，8000 rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100 µl TE充分溶解备用。

4、DNA检测1)取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。

高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7<A260/A280<1.92)将DNA原液适当稀释后，用1 × TAE，0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进行质量检测。

3)向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5 U/µg DNA，37℃消化过夜，用0.5 × TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。

五、实验注意事项1、实验中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危险或有毒物质，操作时要戴手套，并在专门区域操作。

2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。