园艺植物生物技术第三章

Advantages and disadvantages Advantages : 方法简单，效果明显。
disadvantages :
1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶 病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病 毒（千日红病毒）无效。 2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯 死，造成损失 3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物 组织中的抗性因子而降低处理效果。
1).繁殖效率高，生长速度快；
2). 培养条件可控制性强，可周年生产（一般6个增殖周期/ 年）； 3).占用空间小； 4).管理方便，利于自动化控制；
5). 便于种质交换和保存。
1.3 Application
1.繁殖稀缺或急需的良种植物； 2.无病毒苗木的快速繁殖，如草莓、马铃薯、以保持后代的三倍体、单 倍体及基因工程植株的快速繁殖；
热处理方法
（1）愈伤组织热处理
离体培养 愈伤组织 热处理继代 分化培养。 常用温度及时间：低温37—38℃处理2周、4 周或8周；高温50℃处理3—5min。
（2）热空气处理脱毒法
试验母株在高温生长室中生长一段时间， 其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后 切取其茎尖分生组织进行离体培养。
生长室温度35-40℃ 光照3000—10000 lx
Part 2 Rapid propagation in vitro
1. Introduction 1.1 Concept
指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在 人工控制的营养和环境下进行培养，使其在较短时间 内快速地再生出遗传性一致的大量完整植株的方法， 是工厂化育苗的技术基础。
1.2 Advantages of rapid propagation in vitro
1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争 2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌 操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室 内进行培养，并及时观察和记录培养结果。
茎尖培养
①茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.20.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植 体过小茎尖存活率低）
4.拯救濒危植物； 5.种质的保存和交换。
2. Methods
2.1 The establishment of the sterile culture system
1).母株和外植体的选取：母株性状稳定、健壮、无病虫害。 木本与较大草本----茎段、顶芽、腋芽；草本----叶片、叶 柄、花茎、花瓣 2).无菌培养物的获得：15d
受病毒危害严重的作物：
大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草 蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜 果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉 花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰
1.3.4. 节约耕地，提高农产品的商品率
块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年 产品用留作种的比例：
◆大蒜：留种量占产量的五到八分之一 ◆马铃薯：留种量占产量的十分之一 ◆贝母：留种量占产量的三分之一
1.3.5. 便于运输
常规的块根、块茎等，体细胞大、 含水量高，包装、运输十分不便。 离体繁殖的种苗体积小，易携带， 运输十分方便。
以马铃薯为例：
按一亩地4000株计算，常规薯4000个重 200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有 2kg（每个0.5g）。
脱毒与未脱毒马铃薯对比
2. Principal and methods
缺点：
会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗 苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。
2.2.3. micro-grafting
in vitro
应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到 不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗 一起在培养基上培养。 优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来 培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。 微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大 小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关。
（4）电镜检测法
4、 The preservation and propagation of virus- free seedling
4.1 The preservation of virus-free seedling
(1). 隔离保存 专用的隔虫纱网棚室
离体培养
2. 低温保存
将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低 温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。 只需半年或一年更换培养基，也叫最小生长法。
愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些
变异。
（3）Nucellar tissue culture 珠心组织培养 脱毒法
病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束 系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得 无病毒植株。
目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、 柑橘裂皮病、速衰病等病毒。
成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性
, 受体植物无论显、隐症, 无论是何种传播介质, 均可通过抗血 清反应法准确判断病毒的存在与否, 进行病毒的快速诊断。
3.5. Molecular techniques
identification分子生物学鉴定
（1）核酸杂交技术
（2）PCR法 （3）dsRNA分析
3.2. indicating Plant 指示植物法
定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作
为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其他植
物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法.
指 示 植 物
接 穗
嫁接后 的植物
Advantages and disadvantages
Advantages :
d.在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖 。
2.2 methods
物理方法
化学方法
生物方法
高温处理
珠心培养
愈伤脱毒
热处理脱毒
茎尖培养
微体嫁接
2.2.1 Heat treatment 热处理脱毒法
热处理脱毒原理
病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植 物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞 在与病毒繁殖的竞争中取胜。
1.2. Concept ：
采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。
Virus-free seedling 无病毒苗：指不含该
种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒 在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。
1.3 Significance of Plant Virus-Free
1.3.1.能够有效地保持优良品种的特性
3.冷冻保存（超低温保存）
用液氮（-196℃）保存植物材料的方法。常用冷冻保护 剂为DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、 聚乙二醇等。
4.2 The propagation of virus- free seedling
1、继代培养快速繁殖：愈伤、不定芽、丛生芽 2、快繁苗的生根及微型鳞芽的培养
（2）Callus culture 愈伤组织培养脱毒法
1）原理及依据
①病毒在植物体内分布不均匀 ②病毒复制的能力衰退或丢失 ③继代培养的愈伤组织产生抗性变异
2）技术关键 诱导再生植株的愈伤组织
3）操作程序
植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈 伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长 成植株。
2.1 Principal
a.植物病毒本身不具有主动转移的能力
在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分 生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间 连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；
b.在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒 的复制； c.在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中 比其他任何区域具有更高的活性。
任何一种优良品种均需有一 个稳定地保存其遗传性状的繁殖 方法。
离体无性繁殖可以很好地保 持品种的优良特性，是无性繁殖 品种繁育的理想途径。
1.3.2. 快速繁殖品种，使优良品种迅速应用
◆离体繁殖周期短
◆不受季节限制
◆繁殖系数高
◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的，
又称之为 快繁
1.3.3. 生产无病毒种苗，防止品种退化
Horticultural Plant Virus-Free and Rapid propagation in vitro
园艺植物脱毒与 离体快速繁殖
Contents
1. Horticultural Plant Virus-Free
脱毒的意义 脱毒的方法 脱毒植物的鉴定 2. Rapid propagation in vitro 离体快繁 意义 方法 3. Artificial seed 人工种子
看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。
番 茄 无 菌 小 苗
厚 叶 莲 花 掌
植物病毒的症状
植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒 引起外部症状主要有以下几种： ①变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有 ；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。 ②坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑 等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草 等。 ③畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶 等病状。 ④萎蔫 ：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而 发生供水不足所出现的凋萎现象。
方法简单、灵敏、准确、方便
Disadvantages :