壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究
壳聚糖表面胰蛋白酶分子印迹聚合物的制备及性能的研究
壳 聚 糖 表 面 胰 蛋 白酶 分 子 印 迹 聚 合 物 的 制 备 及 性 能 的研 究
张 莹 苏 立 强
（ 齐齐 哈 尔大学 化 学 与化学 工程 学 院 ， 黑龙 江 齐齐 哈 尔 １１０ ） ６０６
摘 要 在壳 聚糖表 面通过 希夫 碱反应 嫁接一层 戊二 醛 ， 成核 一壳结构 微球。然后 在这 个核 一壳微球上 ， 形 以胰 蛋
白酶为模板分子 ， 氨基苯硼酸为 功能单 体 ， 了胰蛋 白酶分 子印迹聚合 物 ， 过静态 吸附法 ， ３一 制备 通 研究了聚合 物的吸
附性能 。结果表 明， 印迹聚合物对模板分子有较 高吸附容 量和特异选择性 。为从 蛋 白质 混和溶液 中分离富集胰 蛋 白
酶提供 了新 的材料和方法 。 关键词 分子 印迹聚合物 胰蛋 白酶 壳聚糖 戊二醛
ｍｉｒ ｓ ｈ ｒ ｓ Ｔ ｒ ｕ ｈ ｓａ ｃ ａ ｓ ｒ ｔｏ ａ ｄ ｔ ｅ ａ ｓ ｒ ｔ ｎ ｐ ｏ ｅ ｔｅ ｆｔ ｅ ｐ ｌ ｍｅ ｓｓｕ ｉ ｄ ｂ ｔｔｃ ａ ｓ ｒ ｔ ｎ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅ ． ｈ ｏ ｇ ｔｔ ｄ ｏ ｐ ｉｎ， ｎ ｄ ｏ ｉ ｒ ｐ ｒｉｓ ｏ ｏｙ ｒｗａ ｔ ｄ ｅ ｙ ｓ ｉ ｄ ｏ ｉ ． ｉ ｈ ｐ ｏ ｈ ａ ｐ ｏ
Ｉ ｓ ｒ ｖｄ ｓａ ｎ ｗ ｔ ｒａｓ ａ ｄ ｍｅ ｏ ｆｔｅ ｅ ｒｃ ｍｅ ｔｏ ｅ ｌｔ ｌｃ ａ ｒ ｍ ｘｕ ｅ ｏ ｒ ｔｉ ｔａｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｅ ｍａｅ ｌ ｎ ｔ ｄ ｏ ｎ ｈ ｎ ｆｔｍｐ ａｅ ｍｏｅ ｕｌ ｆｏ ａ ｍｉｔ ｒ ｆｐ ｏ ｅｎ． ｌ ｉ ｈ ｈ ｉ ｒ
Ｓ ｌｃｉ ｅ Ｅｎ ｉｈ ｅ ｔｏ ｙ ｏ ｙ ｅ ｆｏ ｈ ｏ ｅｎ Ｓ ｍ ｐ ｅ ｎ ｔ ｅ ｅｅ ｔ ｒｃ ｍ ｎ ｆＩ ｓ ｚ ｍ ｒ ｍ ｔ ｅ Ｐｒ ｔｉ ａ ｖ ｌｓｉ ｈ Ｍ ｏ ｅ ｕ ａ ｌ ｍ ｐ ｉ ｔｄ Ｐｏｙ ｅ ｙ ｔｍ ｌｃ ｌ ｒｙ Ｉ ｒｎ ｅ ｌｍ ｒ Ｓ ｓｅ
酶的固定化技术
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。
本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
甲壳素、壳聚糖作为固定化酶载体的研究进展
由于壳 聚糖具 有在 酸 性条件 下溶 解 ，碱 性条 件 下沉 淀 的特 点 ， 以将其 作 为 固定 化 酶的载 体 时 ， 所 先 把 壳聚 糖溶 解于稀 酸 中 ， 滤去不溶 物 ， 向滤液 中滴 加 氢 氧化钠 溶 液 ．收集沉 淀 物作 为载体 。 以下 介 绍 的 几种 固定 化 酶 的载 体一 壳 聚糖 ，是用 上述 方法 处理 的。这样 处 理能使 壳 聚糖有 更多 的 氨基参 与 固定化 反应 ， 因此 固定化 酶 的活力 回收率 较 高。 姜 涌 明… 等以 自制壳 聚糖 为载 体 ， 戊二 醛 为交 联 剂 ， 到固定 化木 瓜蛋 白酶 。活力 回收率 为 ４ ％ 得 ２
３ 舒 展 、 用 酶 促 水 解 改 进 大 豆分 离蛋 白 的乳 化 性能 应 学 报 ．９ ２．（ ）３ —４ １９ ７ ３ ：９ ８ ４ 翟瑞文 、 雁群 、 子林等 李 陈
业科技 １ ９（ ） ３ —４ ９ ７ ５ ：８ ０
中 国 辕 油
玉米 渣 中 蛋 白质 的 酶 水 解
食 品 工
许 多 固定化 酶 的成功 与否 要依靠 载体 的特性 ，因此
载体 的选 择便 成 了研究 的热 点 。
乙酰胺 基 ． 葡萄糖 单 元和 Ｂ（ ，）２ 氨 基 一 葡 萄 Ｄ 一１４．一 Ｄ
糖 单 元组成 的共 聚物 。壳 聚糖 属 多糖类 物质 。亲水
甲壳 素又 名几 丁质 、 多糖 ， 由 ２ 乙 酰胺 一． 壳 是 一 ２ 脱 氧葡 萄糖单 体 通过 口（ ， ） 一１ ４ 糖苷 键联 结起 来 的直
甲壳 素 、 聚糖 作 为 固定化 酶 载 体 的研 究 进展 壳
邢 晓薏 吕晓 砖 宫慧梅 黄 良 昌 天津轻 工业 学 院
固定化胰蛋白酶的制备研究
固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。
胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。
因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。
二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。
其中凝胶是最常用的载体。
2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。
其中，共
价键结合法是最常用的方法。
3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。
三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。
2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。
一般情况下，选择
40℃为最佳条件。
3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。
一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。
四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。
在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。
五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。
其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。
同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。
壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质
壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质肖燕;王娟;周小华【期刊名称】《应用化学》【年(卷),期】2009(26)7【摘要】以具柔性亲水手臂的壳聚糖-精氨酸树脂为载体,用戊二醛交联胰凝乳蛋白酶,获得壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶. 最佳固定化条件为:m(酶)∶ m(载体)=20∶ 1 000、戊二醛体积分数为1.0%、pH=5.20、30 ℃交联60 min. 固定化酶活力达850 U/g,Km为1.83 mmol/L,比游离酶增大33.6%,比交联壳聚糖固定化酶低24.0%. 壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶水解时间进程曲线与游离酶基本一致,均在反应30 min达到最大速率,最适温度为70 ℃,比游离酶升高10 ℃;在75 ℃时的半衰期可达6.0 h,比游离酶提高约4.3倍;最适pH值为5.92,比游离酶向酸性偏移2pH单位. 4 ℃贮存半衰期为49 d.【总页数】6页(P780-785)【作者】肖燕;王娟;周小华【作者单位】重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044【正文语种】中文【中图分类】O636.1;O629.7【相关文献】1.α-胰凝乳蛋白酶在相转移Fe_3O_4纳米粒子表面的固定化 [J], 吴侠;韩玉顺;曹敏花;胡长文;任玲;葛广路2.用于α-胰凝乳蛋白酶固定化的氨基超顺磁纳米凝胶光化学合成与表征 [J], 洪军;徐冬梅;孙汉文;宫培军;董黎;姚思德3.α-胰凝乳蛋白酶的固定化及其对DL-苯丙氨酸的光学拆分 [J], 刘立建4.PNIPAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 陈元安;付建伟5.PAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 付建伟;庄银凤;王国伟;彭颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甲壳素和壳聚糖作为酶和细胞的固定化载体的研究进展
已用多种载体研究了 D 2葡萄糖异构酶 的固定化并已用于工业生产 , 但寻找更理想 的载体材料的研究工作依然在进行, 甲壳素 和壳聚糖是研究的重点之一。
D 2葡萄糖异构酶在甲壳素上的固定, 可
把葡萄糖淀粉酶通过戊二醛键合固定在 甲壳素上后, 具有很好的操作特性。 制备方法 如下 [ 7]: 每份粉状甲壳 素 ( 含水 50% ) 与三 份葡 萄糖淀 粉酶 ( 水 剂 ) 混合 , 加 入液 体总 体积
5 D - 葡萄糖氧化酶
蒸馏水充分洗涤 , 得到的颗粒状的固定化酶 被浸泡在 pH4 的 0. 1 m o l� L 乙酸钠缓冲中 保存。 该固定化酶的活力为游离酶的 67% 。 用 DEA E 2甲壳素固定化葡萄糖 淀粉酶 ( 99. 4 m g �g ) , 具有原酶 1�3 的活力 [8, 9 ]。
3 Β- 葡萄糖苷酶
已经有 D EA E 2Sep hadex A 225、 Duo lite 2 7 、 活性氧化铝、 硅胶等固定化葡萄糖氧化 A 酶, 但制备方法较麻烦, 而甲壳素作载体却要 简单得多 [ 13]。 将蟹壳甲壳素用 2. 5% 戊二醛 处理 3 h, 用 蒸馏 水洗涤 , 然后 加入 酶溶 液 中, 在 5 ° C 放置 过夜 , 过滤 , 洗涤 , 浸泡 在 2 m o l� L KC l 溶液中 , 使用前重新洗涤 , 其活力 保持 100% 。 在制备过程中 , 最佳的 pH 范围 是 5. 0 ～ 8. 0, 更好的是 6. 0。 最佳的使用温度 是 30 ° C , 在 40 ° C 时活力 还有 70% , 而原 酶 在此温度下的活力已很小。
作者简介: 蒋挺大, 男, 1940 年生, 研究员 。
以这样操作 [ 2]: 取 1%～ 10% 甲醛 或戊二 醛 溶液 10 m l, 加 入 50 m g 粉 状甲 壳素 ( 控制 pH 8. 5) , 在室温下搅拌均匀后放置 1 h , 其间 不时搅动一下 , 使甲壳素交联 , 然后用蒸馏水 洗涤 , 除去多余的甲醛或戊二醛。
固定化壳聚糖酶膜的初步研究的开题报告
固定化壳聚糖酶膜的初步研究的开题报告
标题：固定化壳聚糖酶膜的初步研究
研究背景：
壳聚糖酶是一种能够水解壳聚糖的酶类，具有广泛的应用价值。
然而，由于壳聚糖酶具有易失活、易受污染等缺点，在工业上应用受到了一定的限制。
因此，如何提高壳聚糖酶的稳定性和重复使用性已成为一个重要的研究方向。
研究内容：
本研究旨在将壳聚糖酶固定化在膜上，从而提高其稳定性和重复使用性。
具体来说，先将壳聚糖酶与适合的载体材料混合，然后将混合物涂覆在膜上，制成固定化壳聚糖酶膜。
在这个过程中，需要对载体材料、混合物的比例、涂覆工艺等进行优化，并测试膜的稳定性和催化效率。
研究方法：
（1）筛选合适的载体材料，如聚苯乙烯、聚丙烯等；
（2）制备壳聚糖酶和载体材料的混合物；
（3）将混合物涂覆在膜上；
（4）优化涂覆工艺，如溶液浓度、涂覆时间、温度等；
（5）测试固定化壳聚糖酶膜的稳定性和催化效率。
预期成果：
通过本研究，可制备出稳定性较高、重复使用性较好的固定化壳聚糖酶膜，并研究其催化性能。
这将为壳聚糖酶在工业上的应用提供新思路和方法。
壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究的开题报告
壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究的开题报告
一、背景
随着生物技术和生物医学领域的发展，酶在许多应用中都发挥着重
要作用。
然而，自由酶在使用过程中面临着稳定性、重现性等问题，无
法实现长期稳定的储存和使用。
因此，固定化酶成为了一种重要的解决
方案。
固定化技术可以提高酶的稳定性，延长使用寿命，并且可以更方
便地进行回收和重复利用，实际应用和经济效益均有很大的优势。
壳聚糖是一种天然产物，由于其良好的生物相容性、生物降解性和
再生性等特点，成为了固定化酶的优秀载体。
胰蛋白酶是消化蛋白质的
一种常用酶，广泛应用于食品、医药等领域。
二、研究目的
本研究的目的是利用壳聚糖微球作为载体，固定化胰蛋白酶，并对
其进行性质和稳定性的研究。
三、研究内容和方法
（1）制备壳聚糖微球
以壳聚糖为主要原料，采用溶液交联-乳化凝胶化法制备壳聚糖微球，通过控制反应条件和调节配方，得到粒径分布较为均匀、表面光滑的微球。
（2）固定化胰蛋白酶
将制备好的壳聚糖微球与胰蛋白酶进行反应，使其在微球表面固定化。
（3）性质和稳定性研究
通过对固定化胰蛋白酶的工作效率、催化活性、稳定性等进行测试，比较其与自由酶的差异，并进一步探讨其在应用中的优势和局限性。
四、研究意义
胰蛋白酶的固定化研究对于优化酶催化的条件、提高催化效率和稳
定性、推动酶在医疗、生物技术等领域的应用具有重要意义。
本研究可
以为固定化技术的发展和在实际应用中的推广提供理论依据和实践经验。
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第１８卷第２期
离ｒ交换与吸附
．１２７·
３结果与讨论
３．１ 固定化胰蛋白酶最佳条件的确定 ３．１．１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 固定戊二醛用量和给酶量，采用ｐＨ＝５．０一ｌＯ．０范围的缓冲液，分别制备固定化胰蛋白
酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，并测定固定化酶的活力，结果见图１。由图１可见，固定化反 应过程中的ｐＨ值对固定化酶的活力具有很大的影响。固定化胰蛋白酶Ａ，在ｐＨ＝７．０曲．０ 的范围内均具有较高的酶活力。而固定化胰蛋白酶Ｂ，则在ｐＨ＝７．０－８．５的范围内酶的活力 达到最大值。由于固定化胰蛋白酶Ａ的载体是线型壳聚糖，而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体 是网状壳聚糖．它们在不同的口Ｈ条件下，分子链的构像可能不同，则与胰蛋白酶的结合 能力可能存在着一定的差异．同时胰蛋白酶在不同ｐＨ的缓冲液中也具有不同的分子构像， 这些都会影响固定化酶的活力。
万方数据
·１２８·
Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
２００２年４月
壳聚糖在与胰蛋白酶发生偶联作用时，分子链上的游离氨基之问也要进行交联反应，所以 消耗的戊二醛的量较多。而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体壳聚糖已用戊二醛预交联，当与胰蛋 白酶发生偶联反应时，消耗的戊二醛的量则相对较少。
３．１．３固定化反应中给酶量对固定化酶活力的影响 载体上偶联的酶量直接影响着固定化酶的活力。在最适ｐＨ（ｐＨ＝８．０）、最适戊二醛浓
但是，固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ范围有一定的差异．这可能与载 体的结构不同有关．从而造成了固定化酶分子所处的微环境有所不同．
３．２．２ 固定化胰蛋白酶的最适反应温度 取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，在Ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．Ｏ）中，
温度３０曲０℃范围内，测定其对酪蛋白的水解活力，结果见图５。由图可见，原酶的最适 反应温度为５５℃；固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ的最适反应温度均为６０＂Ｃ，并 且在６０＂Ｃ，７０＂Ｃ之间均保持了较高的活力．说明胰蛋白酶用壳聚糖固定化后，其热稳定性 明显提高，可以在较高的温度下进行酶促反应。
１前言
天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物一壳聚搪具有良好的生物相容性与生物亲和性，它在 生物医药领域中的应用研究正蓬勃开展．它作为生物材料．用作固定化酶、亲和层析、金 属螯合亲和层折的载体前景十分广阔【１４ Ｊ。目前研制成功的固定化酶已有上百种．但由于 成本昂贵，真正应用于实际生产的品种为数不多。壳聚糖作为开发应用较晚的阳离子型多 糖用作固定化酶的载体，在结构上具有独特的优势．利用其分子侧链上大量的游离氨基， 再选择适当的交联剂．可以使得酶麸价结合于载体上的反应易于进行．此外壳聚糖还具有 良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点．
２．２固定化胰蛋白酶的制备 固定化胰蛋白酶Ａ（以线型壳聚糖为载体）：取～定量的壳聚糖溶于２％的乙酸水溶
液中，在快速搅拌下，滴加５％的氢氧化钠水溶液至溶液ｐＨ＝７．５．抽滤收集沉淀，可得壳 聚糖的白色细小颗粒。将上述经过再沉淀处理后的壳聚糖置于０．０５ｍｏ｜／Ｌ的Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ缓冲 液（ｐＨ＝８．ｏ）中，加入一定量的胰蛋白酶搅拌均匀后．再滴加～定量的戊二醛水溶液，在 磁力搅拌下反应６ｈ。抽滤，先用蒸馏水洗涤，再用上述缓冲液洗涤，直至洗涤液中检测不 到戊二醛和游离酶，真空干燥后即得颗粒状固定化酶。
’
ａ
．么３ 豸５ ‘ ●
ＴｔＣＤ
圈５温度对胰蛋白酶活力的影响 Ｌ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ．固定化胰蛋白一＾，ｃ原醇
围６固定化酶与原酶的Ｌｉｎｃｗｃａｖｃｒ－Ｂｕｒｋ曲线 ｔ原酶：ｂ固定化麓蛋白■Ｂ；ｔ固定化胰蛋白醇Ａ
３．２．３ 固定化胰蛋白酶和原酶的束氏常数岛 各取多份相等质量的固定化胰蛋白酶Ａ或固定化胰蛋白酶Ｂ或稀释后的原酶，在最适
苞
墨
最
Ｒ
蝗
蜒
荔
靛
翠
霉
图１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 ｔ固定化胰蛋白酶Ａ． ｂ．固定化胰蛋白酶Ｂ
田２固定化反应中戊二鹾浓度对 固定化酶活力的影响
ｔ固定化胰噩白醇Ａ： ｂ固定化馥蛋白酶Ｂ
３．１．２固定化反应中戊二醛浓度对固定化醇活力的影响 以戊二醛为变联剂制备固定化酶时．由于戊二醛既是反应的交联剂，又是酶的变性剂．
ｔ牧聃日期２００２年ｊ月２２日 作者麓卉：陈天．盘＇（Ｔ９６Ｚ－）．江苏省＾．副教授
万方数据
较为接近ａ此实验方法也为壳聚糖用于其它酶的固定化提供了又一个可供选择的新的操 作方法。同时对这两种固定化胰蛋白酶的性质进行了详细的研究，为固定化胰蛋白酶的工 业应用提供了非常有用的实验数据。
２实验部分
２．１试剂与仪器 壳聚糖：自制，脱乙酰化度为９５％：戊二醛：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ产品（浓度为２５％）；胰蛋白
万方数据
白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ均具有较好的热稳定性，它们在６０＂Ｃ保温３ｈ活力几乎保持 不变，８ｈ以后活力缓慢下降．保温１０ｈ相对活力仍然保持在８５。９０％之间。由于游离的 液态胰蛋白酶具有自身消化现象，对热稳定性较差，而胰蛋白酶经壳聚糖固定化后对熟稳 定性有了显著的提高．
游离的液态胰蛋白酶在ｐＨ＝９．０的缓冲液中（不加底物），恒温２５＂（２放置２５ｈ活力几 乎完全丧失。图３为固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ在ｐＨ＝５．０．１０．０的缓冲液中。 恒温２５℃放置７２ｈ后的相对活力．实验结果表明，固定化胰蛋白酶在ｐＨ＝７．０。１０．０范围 内都比较稳定，而固定化胰蛋白酶Ｂ的相对活力保持更高，说明相同条件下它的稳定性更 好。由于在固定化酶中载体壳聚糖对胰蛋白酶的静电作用，使得酶分子构象变得较为牢固， 所以固定化酶的抗酸碱能力有所增强。
其对底物酪蛋白的水解活力，结果见图４。由图可见，原酶的晟适ｐＨ值为８．０，并且酶活 力随ＤＨ值变化的曲线较为陡峭：而固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ值 范围均有所扩大，分别在ｐＨ＝７．５—９．０和ｐＨ＝７．“８．５的范围内都保持了较高的催化活性。
万方数据
第１８卷第２期
离子交换与吸附
·１２９·
享
邑
素
霄
蝗
蝗
智
智
晕
霉
‘１ｗ
圈７胰蛋白酶的热稳定性（６０℃） ｔ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ固定化胰蛋白酵Ａ：ｃ原醇
酶：ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＴＯＲＩＥＳ（ＤＥＴＲＯＩＴ ＭＩＣＨＩＧＡＮ ＵＳＡ）产品：酪蛋白：上海化学试剂 站进口分装；其它试剂均为分折纯。
５３ＷＢ微机型紫外可见分光光度计（上海光学仪器厂）：ＳＨＺ－８２型水浴恒温振荡器（江 苏太仓医疗器械厂）：ＫＪ－ｌ型控温强磁力搅拌器（苏北生化仪器厂）；ＤＨ Ｓ－３型酸度计（上 海第二分析仪器厂）。
离子交换与吸附，２００２，１８（２）１２５～１３Ｉ ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＡＮＤ ＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ 文章编号１００卜５４９３（２００２）０２－０１２５－０７
壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究＋
陈天
扬州大学理学院化学化工系，扬州２２５００２
摘要：以秃聚糖为栽体，戊二醛为交联剂．采用两种方法特备了固定化胰蛋白酶．考察了固定 化反应中ｐＨ值．戊二醛的浓度、吼及蛤酶量时固定化胰蛋白酶活力的影响，并研究了这两种 固定化胰蛋白酶的性质．实验结果表明，以戊二醛预交联的网状壳聚糖为栽体制备的固定化胰 蛋白酶具有更加优良的性能，在最佳固定化反应条件下．酶的活性回收率可速５６％．此固定化 胰蛋白酶的最连ｐＨ为７．¨８ ５、最适温度为６０℃．‰值为２．５２ｍｏＩ．ｔＬ．固定化腱蛋白醇表现出 了较好的热稳定性、ｐＨ棼存稳定性．殂及在乙醇水溶漶中的稳定性． 关键词：壳聚糖胰蛋白醇固定化醇 中囤分类号：０６４７ ３ 文献标识码：Ａ
３．２．４ 固定化胰蛋白醇的稳定性 分别考察了固定化酶的热稳定性、ｐＨ贮存稳定性以及在有机溶荆乙醇中的稳定性，
结果见图７￣９． 在０．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｆｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．０）中．以２％的酪蛋白为底物－加入一定量
的固定化酶或稀释后的原酶于６０＂Ｃ水浴中保温．不同时间后测定酶的活力（图７）·由图 ７可见，原酶在６０＂Ｃ保温ｌｈ活力丧失近４０％，保温３ｈ活力基本全部丧失．固定化胰虽
度（固定化胰蛋白酶Ａ：０．６％：固定化胰蛋白酶Ｂ：０．４％）时，固定载体用量，改变酶的 投料量．分别制备固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，其活力测定结果见图３。由图 ３可见，开始时，固定化酶的活力随着给酶量的增加而升高，当给酶量增加到一定量时， 固定化酶的活力达到最大值后，则固定化酶的活力反而随着给酶量的进一步增加而下降， 这是因为固定化酶的活力并不与载体负载的酶量成正比。当载体负载的酶量达到一定量 后，再增加给酶量反而会增加固定化酶分子之间的拥挤程度，使之与底物结合时的空间阻 碍增大，造成固定化酶括力的降低．在本实验中，固定化胰蛋白酶Ａ的最适给酶量为 ４５ｍｇ／ｇ载体．酶活回收率为５０％：固定化胰蛋白酶Ｂ的最适给酶量为４０ｍｇ／ｇ载体．酶活回 收率为５６％。由此可见，固定化胰蛋白酶Ｂ的给酶量虽少，但酶活力与酶活回收率都较高． 这可能与预交联的网状壳聚糖载体的多孔结构有关，固定化酶在载体上具有较大的自由空 间，故酶分子保持了较高的活性。
胰蛋白酶有着广泛的用途．但由于其易自消化、稳定性较差，它的应用受到了一定的 限制．考虑到这一特点，选择温和的条件制备固定化胰蛋白酶就显得尤为重要。在本研究 中，采用两种方法制各了壳聚糖固定化胰蛋白酶：～是用线型壳聚糖为载体．直接加入胰 蛋白酶和交联剂一戊二醛进行固定化反应：二是用网状壳聚糖为载体。即先用少量戊二醛 将线型壳聚糖预交联成网状壳聚塘后，再加入胰蛋白酶和一定量的交联剂戊二醛进行固定 化反应。第一种方法为常用的以壳聚糖为载体固定化酶的制备方法¨Ｊ．而第二种方法尚未 见报道。实验结果表明．两种方法制备得到的固定化胰蛋白酶具有一定的差异．进行深入 研究后对比发现，第二种方法效果更好，特别表现在酶的活性回收率更高及米氏常数与原
２．３蛋白质浓度的测定 参照文献∽采用Ｌｏｗｒｙ法测定。
２．４酶活力的测定 采用Ｆｏｌｉｎｌ６１原理测定胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶的活力。具体方法如下：以２％的