鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
答案--生物制品复习题
一、填空1、目前基因工程抗体有以下几种类型，包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、 Ig相关分子、噬菌体抗体。
2、按微生物学控制程度由松到严，将实验动物分为普通级动物、清洁级动物，无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物。
7、按遗传质量控制可将实验动物分为四类，即近交系动物、杂交群动物、突变系动物、封闭群动物等。
3、一般生物制品制备流程是：培养增殖、分离纯化、浓缩、制剂、检验。
4、诊断用生物制品的最基本要求是特异性强和敏感度高。
包括诊断用抗原、诊断用抗体和标记抗体三类。
5、细胞因子是一组由机体免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的小分子或中等分子量的可溶性蛋白质与糖蛋白。
根据的细胞因子的生理功能将其为以下种类：、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、促红细胞生长素。
6、基因工程疫苗包括以下几种，即基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白质工程疫苗、转基因植物疫苗。
8、对生物组织与细胞破碎的方法有高压匀浆法、高速珠磨法、超声振荡破碎法、压力法、反复冻融法、化学渗透法、酶溶破碎法等。
20 等。
17、○18、○19 、○9、动物生物制品的质量检验主要包括○16 、○10、抗体具有特异性结合相关抗原、激活补体、结合细胞、介导细胞毒、促进吞噬和通过胎盘等功能。
发挥其抗肿瘤、抗感染、免疫调节与监视、解毒等作用。
11、实验动物通过注射方法给药的方式包有：皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射。
12、生物制品成品的质量检验主要内容包括物理性状检验、无菌检或纯粹检、安全检验、效力检验、其他检验等。
13、对实验动物小白鼠采血的方法有尾静脉、眼眶动脉和静脉（摘眼球法）、眼眶静脉丛、心脏、大血管、断头等。
二、选择题1、下列物质中抗原性最好的是：A、蔗糖B、多肽C、丁酸D、赖氨酸12、下列物质中抗原性最好的是：A、葡萄糖B、蛋氨酸C、乙酸D、多肽2、临产前动物进行计划性疫苗接种，是为了使新生动物获得＿＿。
鸡胚成纤维细胞制备实验
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
胚的培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。
3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。
通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。
- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。
2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。
- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。
3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。
- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。
4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。
- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。
5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。
- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。
2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
原代培养(13)
二、讨论
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精擦试，试剂等瓶口也要擦试。 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时 间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，
TCID50
（50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的
传统表示法， 即能在细胞培养孔或试管内引起50%组织细胞
病变所需的病毒最高稀释度。
实验六 干扰素（IFN）效价滴定
干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能
保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒
数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。
实验结果：
一、结果观察：镜下及染色观察，一般病毒对照孔出现3＋或 4＋，干扰素保护孔CPE不再进展时，可终止反应，并染色。
二、效价计算：
实验七 中和试验 —稀释血清固定病毒法
实验结果：用倒置显微镜及活细胞染色观察。首先观察对照：
V对照（3+～4+）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为
实验小结
实验一 配液
实验二
原代鸡胚成纤维细胞的 制备、培养及观察
一、实验结果观察
• 肉眼观察：培养液颜色、浑浊度等 • 镜下观察：细胞的形态、折光性、轮廓等 • 成纤维细胞形态学特征：细胞呈梭形、长条形或不规则形。 多数情况下细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也 见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形 式。
指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体的效价 （滴度）。
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鸡胚成纤维细胞的制备
一、材料和试剂
1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚
2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠
3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等
二、操作步骤
1、操作前的准备：
○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：
①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：
培养基：MEM
双抗：2%
7.5% 碳酸氢钠：2%
牛血清：6%
3% 谷氨酰胺：1%
⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
○
12分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养。
○
样品的接种
一、材料和试剂
1、细胞：贴壁细胞株
2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶，1.5mlEP管，酒精棉球，废液缸等
二、操作步骤
1、接种前准备：
○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
○7从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
○8打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
２、接种：
○1待成纤维细胞长成单层后（一般是在制备后２４小时），无菌取出要用的五个方瓶，设置成三组实验组两个，空白对照组一个，阳性对照组两个；倒掉原有的细胞培养液，用ＰＨ７.２的无菌ＰＢＳ洗一遍，再按照如下表格分组，加样。
②
次日更换维持液。