药品无菌检查法——培养基灵敏度检查法
药品无菌检查法培养基灵敏度检查法
1?菌种(1)藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)[CMCC(B)28001]
(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2?操作(1)取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新
鲜培养物,分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；将生孢梭菌不含琼脂的需气
菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸入无菌离心管，离心，弃去上清液, 菌体用0.9%无菌
氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。分别取上述菌悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至与细
菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10~ 100个菌并计数。(2)将藤黄微球菌、生
孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真
菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释,
制成1ml中含10~
100个菌并计数。
将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,分别接种至每管装量
为9ml的需气
菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,分别接种至每管装
量为12ml的需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,接
种至每管装量为9ml的真菌培养基3管,以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天
并逐日记录结果。
3.结果判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，
即该培养基的灵敏
度检查符合要求。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液取金黄色葡萄球菌［CMCC(B)
26003］的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内, 在30?35C培养
16?18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10?100个菌。
2.生孢梭菌(Clostridium sporogeneS菌液取生孢梭菌
［CMCC(B)64941］的需气
菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30~
35C培养18?24小
时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10?100个菌。
3?白色念珠菌（Candida albicanS菌液取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌琼
脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至真菌培养基内，在20?25C 培养24小时后，用
0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10?100个菌。
抑细菌和抑真菌试验
在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作
用。用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭
菌、白色念珠菌均10?100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定
的温度，培养3?5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。
如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不
生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
培养基的灵敏度测试
培养基的灵敏度测试 培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。方法如下： 1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。 2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。 原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。 如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。。 建议在正式使用前即应完成对培养基的质量检查。如果在进行灵敏度试验的同时，也使用该培养基进行样品检查，那么，一旦培养基的无菌性或灵明度不符合规定，则检验结果应无效。无论这些质量控制检查试验何时完成，实验室都必须在相关产品放行之前或检验报告发出之前，对所用培养基的无菌性及灵敏度试验资料的完整性和合格予以确认。 灵敏度（促生长）检查试验用菌悬液，可用标准菌种制得，也可向具备适当资质的供应商购买。目前市场上的商用产品，如microball公司的培养基质量检查用的定量质控菌株，小瓶内一个小球上含有10~100CFU。此类产品使用简单，但操作者需严格遵守供应商的使用要求。另外，尽管所购试菌种均附有质量证书，正式使用前，仍必须用倾注平皿法或铺表面法等标准检测方法对菌悬液的微生物数量进行复核确认。
无菌培养基灵敏度验证
××公司 无菌检查用培养基适用性验证资料 文件编号：YZ-GC -004
1.验证目的：为证明硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基适合于细菌，真菌的无菌检查，特制定本验证方案。 2.参照标准：2005版中国药典二部附录XI H无菌检查法。 3.验证项目： 硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基灵敏度检查。 4.验证小组 4.试验材料： 4.1. 被验证培养基： 品名：硫乙醇酸盐流体培养基 规格：批号：生产厂家： 品名：营养肉汤培养基 规格：批号：生产厂家： 品名：改良马丁培养基 规格：批号：生产厂家： 4.2. 仪器设备： 4.2.1. YM50立式压力蒸汽灭菌器 4.2.2. SW-CJ-2F双人净化工作台 4.2.3. JC101型电热鼓风干燥箱 4.2.4.JY-B型生化培养箱(23～28℃) 4.2. 5.PHX-DHS-40x50恒温培养箱(35～37℃) 4.3. 稀释剂： 0.9%无菌氯化钠溶液 4.4. 验证用培养基：
4.5. 验证用菌株： 5.菌液制备： 5.1.取经培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfu∕ml的菌悬液备用。 5.2.取经培养24~48小时的白色念珠菌的改良马丁培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfu∕ml的菌悬液备用。 6.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿） 分别取上述制备的金黄色葡萄糖球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各1ml加入培养皿，每种菌液平行做2皿，注入不超过45℃营养琼脂培养基15~20ml，置30～35℃培养箱培养二天，取上项制备的白色念珠菌菌液1ml加入培养皿，平行做2皿，注入不超过45℃的玫瑰红钠琼脂培养基约15~20ml，置23～28℃培养箱培养三天。 7.无菌培养基的无菌性检查 7.1培养基的配制 硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基29.25g，加1L蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。 营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基18g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。 改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基28.5g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全
无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XIIA
附录XII A 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL 硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL） 琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 2、改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。 4、营养肉汤培养基 胨10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000mL 取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
培养基适用性检查记录
培养基适用性检查记录 质量部
培养基名称：沙氏葡萄糖琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含 菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照沙 氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，20-25℃培养5天计数。被检培养基同 法操作。 四、结果判断 五、结论 本品按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”及培养基适用性检验操作规程检验，结果：□符合规定□不符合规定。
培养基名称：胰酪大豆胨琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]第代 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]第代 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]第代 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml 的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取11个无菌平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌皿30-35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉20-25℃培养5天计数。被检培养基同法操作。 四、结果判断
无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程
无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程 目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。 范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。 依据：中国药典》2015年版 《药品生产质量管理规范》2010年修订 《中国药品检验标准操作规程》2010年版 责任：QC化验员对实施本规程负责。 内容: 1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。 2、材料及设备 2.1 生化培养箱 2.2 生物安全柜 2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供） 2.4 灭菌试管、灭菌注射器 2.5 0.9%无菌氯化钠溶液 2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。3、无菌检查培养基的适用性检查 3.1无菌性检查 取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。 3.2灵敏度检查 3.2.1菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），
并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104] 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B) 63501] 生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F) 98001] 黑曲霉[Aspergillus niger CMCC(F) 98003] 3.2.2菌液制备 3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备 3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3ml 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨，使之成为均匀悬液。 3.2.2.1.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。 3.2.2.1.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。 3.2.2.1.4 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌。 3.2.2.2 生孢梭菌菌悬液的制备 3.2.2.2.1取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30～35℃培养18～24小时，取一支灭菌中试管，用灭菌注射器吸取硫乙醇酸盐流体培养基中底部三分之二处的新鲜菌液1ml，加入
实验用培养基适用性检查标准操作规程
起草人Prepared by: 起草日期 Date: _____________________ QC 审核人Reviewed by: 审核日期 Date: _____________________ QC 审核人Reviewed by: 审核日期 Date: QA 批准人Approved by: 批准日期 Date: 质量部QD
目的Purpose 为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。 范围Scope 本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。 职责Responsibility 分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。 主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。 内容procedure 1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。 2试验用菌种及培养基 2.1菌种: 2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。 2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633] 2.1.3大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739] 2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] 2.1.5白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231] 2.1.6黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404] 2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028] 2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027] 2.2培养基 2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。 2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-Casein Digest Broth 2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-Casein Digest Agar 2.2.4沙氏葡萄糖琼脂Sabouraud Dextrose Agar 2.2.5肠道菌增菌肉汤Enterobacteria Enrichment Broth Mossel
无菌检查法-2015版中国药典
无菌检查法-2015版中国药典 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g (或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2. 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨17.0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾2.5g 葡萄糖（一水合/无水）2.5g （2.3g）纯化水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄
无菌检查法
无菌检查法
目录 一、培养基 (2) <一>培养基的制备 (2) <二>培养基的适用性检查 (3) 二、稀释液、冲洗液及其制备方法 (4) 三、方法验证或试验 (4) <一>菌种及菌液制备 (4) <二>验证方法 (4) <三>结果判断 (4) 四、供试品的无菌检查 (4) 五、供试品处理及接种培养基 (5) <一>薄膜过滤法 (5) <二>直接接种法 (6) 六、培养及观察 (7) 七、结果判断 (7)
无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 一、培养基 <一>培养基的制备 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌） 酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml；L-胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g（或硫乙醇酸0.3ml）；水1000ml；酵母浸出粉5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2、改良马丁培养基（用于培养真菌） 胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 改良马丁培养基置23～28℃培养。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证。 4、营养肉汤培养基 胨10g；牛肉浸出粉3.0g；氯化钠5g；葡萄糖5.0g；水1000ml。 取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使 灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2
计数培养基适用性检查记录
计数用培养基适用性 检查记录 1检查方法：《中国药典2015版》四部非无菌药品微生物限度检查法：微 生物计数法（通则1105）。 2.验证用仪器型号及编号: 霉菌培养箱：型号 3 ?菌液制备：验证用菌种第（）代 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆 胨液体培养基上，于30?35C 培养18?24h ;上述培养物用氯化钠蛋白胨缓冲液 10倍递增稀释至1ml 含菌数为50?lOOcfu 的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基上，于 20?25C 培养 2?3天;上述培养物用氯化钠蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至1ml 含菌数为50? 100cfu 的菌悬液备 用。 将黑曲霉菌菌悬液用氯化钠蛋白胨缓冲液 10倍递增稀释至1ml 含菌数为50? 100cfu 的菌悬液备用。 4.培养基配制 立式蒸汽灭菌锅： 型号 编号: 生化培养箱 型号 编号: 编号:
按相应培养基产品说明分别配制胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养 基、玫瑰红钠琼脂培养基、R2A琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基、沙氏 葡萄糖琼脂对照培养基、玫瑰红钠琼脂对照培养基、R2A琼脂对照培养基，并按 照相应的灭菌方式灭菌备用。 5、培养基计数适用性检查 胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检查 分别接种不大于lOOcfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、 白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液置直径90mm的无菌平皿中各2皿，另一个皿不 接种菌作为空白对照。倾注20ml温度不超过45C熔化的胰酪大豆胨琼脂对照培养 基，混匀，凝固。将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的平皿 倒置于30-35C的生化培养箱培养不超过3天，计数；将接种白色念珠菌、黑曲霉菌的平皿倒置于30-35C的生化培养箱培养不超过5天，计数。被检培养基同法操作。结果见表1。 表1 培养基适用性检查结果 且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。
SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471
SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471 GMP标准文件分发号: 流水号:471 编码: SOP-QC-03000 共2页第1页题目: 培养基灵敏度检查标准操作规程 制定人 QA审核批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量技术部 颁发日期生效日期 质量技术部分发部门 目的:建立培养基灵敏度检查标准操作规程，保证无菌检查结果的准确性、可 靠性。范围:适用于培养基灵敏度检查。 职责:QC无菌检验员。 规程: 1 实验设备及用具: 高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、注射器、针头、注射器盒、试管、试管架、搪 瓷托盘、时钟、75,酒精棉球、无菌服。 2 培养基:需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)、真菌培养基，培 养基的配制详见《培养基配制标准操作规程》。 3 测试用菌种 3.1 藤黄微球菌[CMCC (B) 28 001] 3.2 生孢梭菌[CMCC (B) 64 941] 3.3 白色念珠菌[CMCC (F) 98 001] 4 操作 4.1 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜 培养物，分别用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌不含琼脂的需 气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸至无菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用
0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。分别取上述菌悬液,用0.9,无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。 4.2 取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10—100个菌并计数。 4.3 将藤黄微球菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别 GMP标准文件接种至每管装量为12ml需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。 5 结果判定:以每珠菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。 题目: 培养基灵敏度检查标准操作规程共2页第2页
无菌检查法验证方案
XXX无菌检验方法学验证方案 编号：VP.SV.039.00
目录 验证方案的审批 验证小组名单 验证实施进度 技术性文件 引言 1．概述 2．验证目的 3．职责 无菌检查方法学的确认 再验证周期
验证方案审批
验证小组名单 验证实施进度 技术性文件
引言 1.概述 1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方 法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。 2.验证目的： 2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验， 寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。 3.职责 3.1验证办 3.1.1负责验证方案的审批。 3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。 3.1.3负责验证数据及结果的审核。 3.1.4负责验证报告的审核。 3.1.5负责再验证周期的确认。 3.2质量监控部 3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。 3.2.3负责取样及样品检验。 3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。 3.2.5负责拟订验证方案。 3.2.6负责组织试验所需设备。 3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。 3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认 1.验证环境、设备及实验前准备： 1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或 隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。 1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗 设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅 特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实 业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公 司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭 州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备 厂)；。⑧微孔滤膜（孔径0.45μm直径50mm）… 1.3供试品： 1.4所需培养基： 1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定 厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定 厂家：北京三药科技开发公司； 营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 1.5稀释液、缓冲液： 0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页) 1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102] 生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F） 98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶 (管)，培养 14 天，结果应无菌生长。 2.方法学验证: 2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
培养基的灵敏度检查操作SOP
培养基的灵敏度检查操作SOP 1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。 3 责任者QC检验人员。 4 内容 4.1 试验设备及用具： 无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。 4.2 使用的菌株： 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003, 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104， 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501， 生孢梭菌CMCC(B)64941， 白色念珠菌CMCC(F)98001， 黑曲霉CMCC(F)98003， 培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。 4.3 检测频率 每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。 4.4 操作方法 4.4.1 对照标准培养基 用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。 4.4.2 试验培养基 将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。液体类的培养基直接使用。 4.4.3 菌悬液的制备 购买对应的商业化定量菌株。使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。目前有进口的bioball和国产的microball等。使用方便，定量精确。
4.4.4 培养基的生长促进实验 4.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进试验 每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1） 4.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验 每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。 4.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验 4.4. 5.1 液体培养基的生长促进特性试验 接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。 4.4. 5.2 固体培养基的生长促进特性试验 采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的最短期限。接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。 4.4. 5.3 液体或固体培养基的抑制特性试验 用适当培养基接种至少100 CFU适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的最长期限。无受试微生物生长。
无菌检查法
1. 目的： 建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2. 范围： 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。 3. 责任： 化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。 4. 定义： 无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。 5.内容： 5. 1无菌操作设备： 无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。 5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌 衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局 部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外 光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。 5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及 可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完 毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半时。 5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程 中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯 旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板： 在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间 的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露
30分钟后 将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加 总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／ 升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况 定期置换过滤器。 5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、 75％酒精棉及拖鞋等。 5.2仪器、用具： 5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。 5.2.2用具的包扎： 5.2.2.1移液管 在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。 5.2.2.2试管 在管口塞上纱布棉塞。 5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩 将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。 5.2.2.4注射器 洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。
无菌检查法验证要点
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法验证 方案及报告 验证方案申请人:验证方案审核人:验证方案审批人:日期: 日期: 日期: 年 年 年 月 月 月 日 日 日
浙江红雨医药用品有限公司 1 概述 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于 实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品 受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的 验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2 验证目的 对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本 公司产品的无菌检查。 3 实验原理 直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作 用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。 本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得 出直接接种法无菌检验的有效性。 4 验证范围 实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。 5 6 职责 7 验证内容 建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比 较观察菌落的生长状况，得出结论。 8 验证指示物 本实验所用菌种为购于浙江省食品药品检验研究所标准菌株:金黄色葡萄球菌、白色 念球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌。
培养基的灵敏度检查操作规程
培养基的灵敏度检查操作规程 1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 2 适用范围本标准适用于培养基灵敏度检查。 3 责任者 QC 检验人员。 4 内容 4.1 试验设备及用具：无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯 等。 4.2 使用的菌株： EP 检测用 ATCC 的菌株： 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538 大肠埃希菌 Escherichia coli ATCC 8739 沙门氏菌 Salmonella enterica subsp ATCC 14028 黑曲霉 Aspergillus niger ATCC 16404 培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5 代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。 4.3 检测频率 每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。 4.4 操作方法 4.4.1 对照标准培养基 用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。 4.4.2 试验培养基 将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45 C左右，以无菌的方式在无菌培养皿 中注入15?20mL,备用。液体类的培养基直接使用。 4.4.3 菌悬液的制备 4.4.3.1 细菌菌悬液的制备
取细菌的斜面培养物1耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中30-35C培养18-24h,取上述培养物用无菌水按10倍系列稀释，分别制成10-7-10-8的菌悬液备用。 4.4.3.2 霉菌菌悬液的制备 取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水 4mL 制成孢子悬液，取上述孢子悬液按 10 倍系列稀释，分别制成 10-6-10-7的菌悬液备用。 4.4.4 培养基的生长促进实验 4.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进试验 每株菌用 2 个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种 0.1-0.5mL 的菌悬液（约10-100CFU 试验菌），同时用 2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的 70%-150%范围内。（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录 1） 4.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验 每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用 2 个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。 4.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验 4.4. 5.1 液体培养基的生长促进特性试验 接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。 4.4. 5.2 固体培养基的生长促进特性试验 采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的最短期限。接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。 4.4. 5.3 液体或固体培养基的抑制特性试验 用适当培养基接种至少 100 CFU 适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的最长期限。无受试微生物生长