无菌检查法演示实验演示教学
无菌检查法培训PPT课件
表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
1
无 菌 检 查 法
2
表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量
1
无 菌 检 查 法
2
表3. 固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数
无 菌 检 查 法
五、实验材料的准备
培养基及稀释液 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
实验设备 过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子） 电子天平 压力蒸汽灭菌器 电热鼓风干燥箱 恒温培养箱 集菌仪
无 菌 检 查 法
5、供试品的准备
操作前，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。
无 菌 检 查 法
以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160℃ 2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用。
无 菌 检 查 法
培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。
无 菌 检 查 法
202X
无Байду номын сангаас检查法培训
01.
无
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03.
检
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无菌检查ppt课件
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4
三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
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八、验证方法——薄膜过滤法
供试品稀释、 过滤 √ —— √ —— √ ——
√
菌株
金葡 金葡 大肠 大肠 生孢 生孢
枯草
菌量
培养基
组别
流乙醇酸盐流 体培养基
最后一次冲洗 液加菌＜ 100cfu/ml
精选编辑ppt
13
八、验证方法
目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。
无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。
医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已 转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选 用直接培养法。
3、培养基适用性检查
①无菌性检查——排出培养基本身的污染，避免无菌试验过程 中由培养基引起的假阳性
②灵敏度检查——确保培养基营养性良好，对微生物具有生长 促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引起的假阴性
注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。
注射剂Microsoft PowerPoint 演示文稿 (2)
– 除气：在阳柱后附加脱气塔 (除去经陽柱后产生的CO2，减轻陰柱负担) 3.电渗析法净化处理 原理：原水在外加电场下通过离子交换膜去除离子而净化 应用：同去离子水 4.蒸餾法制备注射用水 蒸餾器的要求：具脱气及隔沫装置 (去除挥发气体及热原进入) 5.反渗透法制备注射用水 (半透膜具有渗透及反渗透作用) 反渗透法制备注射用水： 加压下原水透过(φ ：0.5~10nm)半透膜而纯化
〈二〉容器、用具器皿的热原去除 (物理、化学法) 1.高温破坏：180＋℃/2＋h 2.酸碱及氧化剂破坏法 热原的检查 1.家兔法(C.P.：热原检查法) 动物：家免三只、体重：1.7~3.0Kg/只 给药及判断：耳静脉给药；按CP檢查法判定 2.鲎试验法(C.P.：细菌内毒素检查法：判断内毒素限量法) 检查原理：0.0001ug/m1热原＋鲎试剂→凝胶反应 特点：简单、迅速、灵敏 可靠性差(假阳性、革陰菌热原敏感) (仅为生产过程的控制，不能代替家兔法)
• 【不溶性微粒】
• 【无菌】照“无菌检查法”（附录Ⅺ
• 三注射剂在生产与贮藏期间应符合下 列有关规定
• 1、溶液型注射液应澄明；除另有规定外，混悬型注射液药物粒度应 控制在15μ m以下，含15～20μ m（间有个别20～50μ m）者，不应超 过10%，若有可见沉淀，振摇时应容易分散均匀，不得用于静脉注射 或椎管注射；乳液型注射液应稳定，不得有相分离现象，不得用于椎 管注射，静脉用乳液型注射液分散相球粒的粒度90%应在1μ m以下， 不得有大于5μ m的球粒。静脉输液应尽可能与血液等渗。 • 2、注射剂所用溶剂必须安全无害，并不得影响疗效和质量。一般分 为水性溶剂和非水性溶剂。 • （1）水性溶剂最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9%氯化钠溶 液或其他适宜的水溶液。 • （2）非水性溶剂常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆 油，其质量应符合“大豆油（供注射用）”标准；其他还有乙醇、丙 二醇、聚乙二醇等的水溶液。 • 3、配制注射剂时，可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压 调节剂、pH值调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。
无菌检查法试验具体操作方法PPT课件
工作环境的污染
实验器材的污 染
培养基的污染
支原体 污染源
操作者本身的污染 某些支原体在人体 是正常菌群
制备细胞的原始组织 或器官的污染
四、具体检测方法
❖ 图为GHK细胞
当支原体污染后，因为它们不 会使细胞死亡可以与细胞长期 共存，培养基一般不发生浑浊， 细胞无明显变化，外观上给人 以正常感觉。
实则细胞受到多方面潜在影响， 如引起细胞变形，抑制细胞生 长等。
❖ 对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 ❖ 通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。
四、具体检测方法
❖ 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是 个世界性问题。
❖ 在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，国 内外研究表明，大约有二十多种支原体能污染 细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支 原体。
三、无菌操作要求及注意事项
4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留 在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有 害物带入培养基中。 开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止因 温度过高灭活供试品。 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有 毒气体，危害供试品。
5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试管 平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快，以 防空气流动，增加污染机会。
无菌试验对培养基的质量要求高，应选用完全透明无 沉淀的培养基，确认检查合格后放入试管架中，置操 作间，方可使用。
二、试验物品准备
❖在选取培养基时，放于眼 前细致观察（包括PH值，装 量是否一致、试管有无裂痕） ❖因培养基在搬运过程中， 容易造成个别试管胶栓松动， 从而影响PH值的细微变化。 ❖如不细致察看，在试验中 会存有很大的隐患，影响结 果的判定。
外科动物实验
外科动物实验外科动物实验实验一无菌术操作 2学时[目的与要求]1、手术人员的手臂肥皂刷洗、碘伏涂擦消毒法2、穿无菌手术衣、戴无菌手套法；3、病人手术区消毒后的铺无菌巾法。
[教学内容]（一）手术人员的无菌准备技术1、术前一般性准备：穿自备（相当于手术室）清洁鞋、戴口罩、帽子和穿洗手衣。
2、手臂洗刷与消毒（外科洗手）：重点训练肥皂刷手臂和碘伏涂擦手臂消毒法。
3、穿无菌手术衣4、戴无菌手套（干手套）（二）病人手术区皮肤消毒后的铺巾：重点训练腹部手术巾和手术洞巾单铺法。
[方法]1.教师分组：教师分2个小组，每组2人，按教学内容固定分工，各司其教；2．学生分组：全班同学按学号划成4个大组，分头前往教师组进行单项目内容学习，每项内容约30分钟时，然后进行交叉轮换；3．学习时，先由老师介绍操作过程，重点讲解正确操作要领和注意事项，同时要纠正初学者容易犯的错误；然后同学跟随老师的示范操作步骤进行模仿训练。
训练期间，每个同学都要严格实施肥皂刷洗手臂及碘伏涂擦消毒操作全过程一次，必要时抽查同学进行洗手后的细菌培养；其他项目的训练则必须反复进行多次。
[思考]同学通过对外科总论实验室这样类似医院手术室内环境的适应以及相关设备的使用，初步建立起“在手术室工作”的理念。
尤其通过教师示范介绍外科手术需做好的无菌术中的两项重要内容，即：①“手术人员的手臂刷洗和消毒、穿无菌手术衣、戴无菌手套”②“病人手术区消毒后的铺无菌巾”。
然后由同学进行模仿操作训练，这样就使同学不仅可巩固大课所学过的无菌术理论知识，而且进一步学会手术人员如何进行自身相关术前无菌准备和在为病人手术区皮肤消毒后如何围绕切口周围铺无菌巾，从而扩大无菌屏障范围。
以上两项无菌术内容实际上是无菌操作中最重要的技术，要求每个同学都必须严格遵守并予以学会。
实验二识别及使用常用器械、练习外科打结法3学时[目的与要求]1、学会并熟练掌握外科手术基本操作之一、打结法；2、学会并一般掌握深部打结法和使用器械打结法；3、了解结的种类，了解方结、三重结、以及外科结的应用，防止打假结、滑结；4、熟悉常用手术包内手术器械的名称，了解常用手术器械的结构特点、基本性能和使用方法；5、掌握手术刀片的正确上、下法；正确的握持血管钳法；左、右手松钳法；正确持剪、剪线法；正确持针钳夹针法、穿针引线法。
无菌检查法标准操作规程
无菌检查法标准操作规程目的：建立无菌检查的基本操作，为无菌检查人员提供正确的操作规程。
2.依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。
3.范围：本标准适用于QC无菌检查的操作。
4. 职责：QC无菌检查人员对本标准的实施负责。
5.程序：5.1. 定义：无菌检查法：系指检查药品、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。
5.2. 无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（18~26）℃及除湿装置，操作室或工作台应保持空气正压。
5.2.1. 无菌室的清洁与消毒应符合QC洁净室清洁、消毒规程（SOP ZL0014）。
5.2.1.无菌室无菌程度的检查应符合规定：见沉降菌监测规程（SOP ZL0006）、悬浮粒子监测规程（SOP ZL0005）。
实验设备及用具：5.3.1.电热干燥箱、电热手提式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、试管、注射器、针头、试管架、刻度吸管、手术剪、手术镊、砂轮、注射器盒、搪瓷托盘、双碟、75%酒精棉球、无菌工作服（衣、裤、帽、口罩等）。
5.3.2.微孔滤膜：直径50mm、孔径0.45μm，应符合规定。
5.3.3.除菌滤器：除菌滤器采用的是HTY-2000型全封闭式薄膜过滤器。
5.3.4. 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照进入QC无菌室物品清洁、消毒、灭菌规程（SOP ZL0015）进行操作。
5.4. 稀释剂：灭菌注射用水。
5.5. 培养基：5.5.1.需气菌、厌气菌培养基（流体硫乙醇酸盐培养基）；真菌培养基。
5.5.2. 培养基的使用，配制、管理及灵敏度检查应按照培养基管理规程（SMP ZL0036）、培养基灵敏度检查规程（SOP ZL0019）、培养基配制规程（SOP ZL0016）进行操作。
5.6. 对照用菌液：5.6.1. 金黄色葡萄球菌（Staphyoccus sureus）菌液：取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30~35℃培养16~18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。
医疗器械的无菌和初始污染菌检验
培养基的适用性检查
灵敏度检查： 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5
代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并 采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)［CMCC（B） 26 003］
医疗器械无菌和初始污染菌 检验技术
医疗器械无菌检验技术
什么是无菌检查法？
用于检查要求无菌的医疗器械是否无菌的一种 方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了 供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌试验的目的：将医疗器械或其浸提液接种于 培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
医疗器械无菌检验标准
种新鲜培养物 至相应培养基 中培养，将培 养物用0.9%无 菌氯化钠溶液
制成菌悬液 （浓度小于 100cfu/mL）
金葡、铜绿、枯 草、生孢各2支， 另一支不接种做 空白对照，培养 3天
改良马丁培养基 （9mL） 5支： 分别接种小于
逐日观察结果：
空白对照管应 无菌生长，若 加菌的培养基 管均生长良好， 则灵敏度符合
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在 （2～8）℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在
（2～8）℃，在验证过的贮存期内使用 。
培养基的适用性检查
平板划线法-斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一 环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线（3-4）条， 再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却 后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第 二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。
培养基的适用性检查
海南讲课无菌检查法 PPT课件
150 500 取100mg或1cm×3cm
最少检验数量 （瓶或支）
20 10 10 10 20
缝合线、一次性医用材料
整个材料
10
带导管的一次性医疗器具
10
（输液袋）
其它医疗器具
整个器具（切碎或拆
20
散开）
检验量-1
是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。 除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、
2019/8/25
7
无菌检查法的局限性-3
检验条件的局限：无菌检查法是根据试验的培养基中 是否有微生物生长来判断样品的无菌性，液体培养 基浑浊一般表明样品受微生物的污染。 因此 ,样品中 污染的微生物的检出受多种因数的影响，只有在各 检验条件符合污染微生物的修复和生长时，才能保 证被检样品的无菌检验结果的准确性。
污染的检出率要比实际产品的污染率低。
2019/8/25
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无菌检查的设施及环境要求
2000版：无菌检查在局部洁净度100级的单 向流空气区域内。
2005版：环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单项流空气区域。
无菌隔离系统。
2019/8/25
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保证无菌试验结果正确判断的先决条件。 防止试验过程污染的措施不能影响试验中应生长的 微生物的生长。 无菌室的清洁处理：试验前后。 试验物品：如有可能，进入无菌操作区的所有物品
2019/8/25
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无菌试验用培养基
无菌检查法是建立在样品污染的微生物能在 规定的培养基中生长的基础上。因此，无 菌检查用的培养基质量是无菌试验成功与 否的关键因素。适宜的培养基制备方法、 贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养 基的保证。
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2020/8/20
35℃,培养72小时.
再验证试验
500:冲洗液体积500ml; 700:冲洗液体积700ml.
(2)铜绿假单胞菌10104 (3)枯草芽孢杆菌 63501 (4) 金黄色葡萄球菌26003
• 总取样量：15g / 每株试验菌
2020/8/20
3
2
1
＋
+:对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml.
2020/8/20
35℃,培养24小时.
＋
1
2
+:对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml.
64901
10104
63501
26003
2020/8/20
5.稀释液以及冲洗液
• 0.1%蛋白胨水溶液 ——稀释液 （如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤） • 聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 ——
非水溶液制剂供试品的冲洗 • 十四烷酸异丙酯 ——膏剂和粘性油剂的
溶剂 ，膜滤除菌
2020/8/20
6.供试品的无菌检查
35℃,培养48小时.
2020/8/20
结论2:
1. 红霉素对生孢梭菌生长无抑制作用. 2. 红霉素对铜绿假单孢菌生长无抑制作用
.
2020/8/20
＋
1
2
3
＋ :对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml.
2020/8/20
35℃,培养72小时.
结论3:
1. 红霉素对枯草芽孢杆菌有抑制作用.
• 灵敏度检查 硫乙醇酸盐流体培养基
12ml，9支，4种菌，35 ℃培养3天；
改良马丁培养基
9ml，5支，2种菌，25 ℃培养5天。 结果判断:空白管应无菌生长,加菌管均生长良好
• 菌液制备（＜100 cfu/ml 的菌悬液）
2020/8/20
硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查 试验
生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌
• 薄膜过滤法 （选择供试品对其生长有抑制 作用的菌株做方法学考察）——考察冲洗量 以及其他灭活方法的效果
2020/8/20
直接接种法
（方法学验证试验 ）
• 取红霉素眼膏一支，无菌操作取出全部内 容物，移入含适宜乳化剂的稀释液中，充 分混合，作为供试液；
• 量取一定体积供试液（相当于固体取样量 150mg）置相应的培养基中；(改良马丁）
0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液冲洗薄膜
2020/8/20
加培养基培养14天
已知信息：
• 上市抽检样品 • 膏剂和粘性油剂供试品 • 规格：2.5g：12.5mg红霉素 • 薄膜过滤法（阳性对照增加1/2最小检验量）
依据以上的检品信息，查表3确定最少 检验数量以及最少取样量
2020/8/20
15支，每支取样1克，总接入量15克 • 冲洗液用量：2100ml，（700ml/筒） a.阳性对照—金黄色葡萄球菌（＜100 cfu
）
b.供试品 c.阴性对照 • 硫乙醇酸盐流体培养基 2•020/8改/20 良马丁培养基
结果判断 规定温度，培养14天 供试品
a.无菌生长，同时阳性管有菌生长 符合规定 ☺ √ b.有菌生长 不符合规定 Χ
• 接入相应的试验菌 （黑曲霉 or 白色念珠菌）
• 同时做阳性对照
• 25℃培养3～5天，逐日观察
/8/20
结论1:
1. 红霉素对黑曲霉生长无抑制作用. 2. 红霉素对白色念珠菌生长无抑制作用.
2020/8/20
• 薄膜过滤法——考察冲洗量 （方法学验证试验 ） • 试验菌： (1)生孢梭菌64901
2020/8/20
3.培养基
• 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃
红色氧化层（h＜深度的1/5）， 100℃水浴加热除去氧化层，
时间不超过20分钟
• 改良马丁培养基
23～28℃
2020/8/20
灭菌后放置3天的培养基
沸水浴 加热10min
2020/8/20
4. 培养基的适用性检查
• 无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶）,培养14天 ,应无菌生长。
2. 每筒加样量5g(相当于红霉素25mg), 冲洗液体积400ml,枯草芽孢杆菌48小 时后可见微弱生长,72小时生长良好.
3. 在该检验条件下,冲洗400ml,三天内可 检出枯草芽孢杆菌.
2020/8/20
＋
1
2
3
+:对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积
400ml.
2020/8/20
提纲
1.定义 2.常见检验品种 3. 4.培养基及培养基的适用性检查 5.稀释液以及冲洗液 6. 无菌检查法实例 7.方法学验证试验
2020/8/20
1.定义:系指用于检查药典要求无菌的药 品、医疗器具、原料、辅料及其他品 种是否无菌的一种方法。
<符合规定>的意义: 仅表明了供试品在该检验条件下未发 现被微生物污染。
• 作用：溶解膏剂中的凡士林，使红霉素 分散均匀。
• 十四烷酸异丙酯实际用量25ml • 萃取液：0.1%蛋白胨水溶液200ml • 冲洗液：（检细菌、检真菌、阳性对照）
0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液2100ml （阴性对照：冲洗液400ml）
2020/8/20
小结：
• 薄膜过滤法： 阳性对照增加1/2最小检验量 检验数量：
明确检验数量 与检验量 根据供试品的情况，确定检样数量
• 批出厂or上市抽检； • 固体制剂or液体制剂； • 直接接种法or薄膜过滤法
参考药典附录90-91页表1，表2，表3
2020/8/20
示例：红霉素眼膏——无菌检查
• 检验流程：取规定量供试品
十四烷酸异丙酯溶解
0.1%蛋白胨水溶液萃取
取水相作为供试液薄膜过滤
c.试验结果无效，须复试 ① 设备环境原因 ② 试验过程染菌 ③ 阴性管有菌生长 ④ 无菌操作不当 d.阳性管规定时间内无菌生长 （2~3天内 ）
须重新进行方法验证
2020/8/20
7.方法学验证试验
• 当供试品为新的产品或供试品的组分、检验 条件发生改变时， 需进行方法学验证
• 直接接种法 （6个菌株） ——考察供试品是 否有抑菌作用
• 本品装量2.5g ：300mg≤ M ＜ 5g • 最少检验数量—— 供试品 + 阳性对照：
10 + 5 = 15 支 • 每支最少取样量 ：150mg
• 每支实际取样量：1g左右 （约为装量的2/5）
• 共计的接入量——15克左右
2020/8/20
• 十四烷酸异丙酯的用量约为供试品总接 入量的1倍～2倍左右。