安捷伦氨基酸柱前衍生分析方法
柱前衍生HPLC法测定复方氨基酸注射液（20 AA）中氨基酸含量
柱前衍生HPLC法测定复方氨基酸注射液（20 AA）中氨基酸含量方方;纪宇【期刊名称】《中国药品标准》【年(卷),期】2016(0)1【摘要】Objective:To establish a new HPLC method for the determination of 18 kinds of amino acids , including asparagine and ornithine hydrochloride in Compound Amino Acid Injection (20AA).Methods: With γ-aminobutyric acid as internal standard , after pre-column derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate ( AQC) , 5μL of amino acids derivatives was injected and separated on a Kromasil C 18 column(4.6 mm ×250 mm,5 μm) with 140 mmol・ L-1 ammonium acetate buffer solution as mobile phase A and acetonitrile-water ( 57∶43 ) as mobile phase B , and detected at 248 nm.Results:18 kinds of amino acids derivatives showed good linearity ( r=0.994 7-0.999 7 ) in the range of 1.2-108.8 μg・ mL-1 .The average recoveries of high , middle and low concentration were 97.4%-103.1% with RSD of 1.3%-3.7%( n=9 ) , respectively.Conclusion:This method was convenient , accurateand superior to the working standard method .%目的：建立柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液（20AA）中包括门冬酰胺和盐酸鸟氨酸在内的18种氨基酸含量的方法。
柱前衍生_高效液相色谱快速测定皮革和头发水解液中的氨基酸
Abstract Ob jec tive : T o deve lo p a fast H PLC m ethod for deter m ining 17 comm on am ino acids in hydro ly sate o f leather and ha ir . M ethods : Am in o acids w ere separated on D ionex A ccla i m C18 ( 4 . 6 mm
-1
150 mm, 5 m ) co lu mn
w ith in 32 m in using 140 mm o l L sod ium acetate buffer so lution at pH 4 . 45 and 4 . 95 for grad ien t elution w ith acetonitrile- w ater( 60 40 , v /v ) and UV for detection after derivatization w ith A ccQ T ag derivatization reagen. t Re sults : The RSDs( n = 5) of retention t i m e and peak area of all am in o ac id sw ere less than 1 . 1 % and 5 . 0% , respec t iv e ly. T he li m it of detect io n( S /N = 3) w as in th e range o f 2 . 92- 4 . 51 pm o,l the linear range w as in the range o f - 1 - 1 2 2 . 5- 500 m o l L ( 1 . 25- 250 m o l L for cystine) w ith R 0 . 998 . T he spiked recovery of leather and ha ir w ere in the range of 80 . 1 % - 102 . 3 % and 85 . 3% - 103 . 2 % , respect iv ely. Conclusion: T he m ain advantages of the m ethod are si m p lified for the preparatio n o f m ob ile phase , cost sav in g , h ig h speed and less m atrix in terfer ence . It can be used for am ino acids deter m in ation in hydro ly sate of leather and ha ir effective ly . K ey w ord s : a m ino ac id s ; H PLC; pre- co lum n derivatizatio n ; leather ; hair 随着现代皮革工业的发展, 皮革化工材料及制 革理论都不断向现代化迈进 , 由于生皮的主要组成 是蛋白质, 整个制革过程离不开对蛋白质的研究, 氨 基酸是构成蛋白质的基本单元 , 因此分析氨基酸可 对蛋白质与皮化材料的相互作用作深入研究 , 从而 可推动现代皮革工业的快速发展。而毛发是提取各 种天然氨基酸的原料, 因此对皮革与毛发中氨基酸
氨基酸柱前衍生化方法
氨基酸柱前衍生化方法
氨基酸柱前衍生化方法是一种常用的氨基酸分析方法，它可以将氨基酸转化为易于检测的衍生物，从而提高检测的灵敏度和准确性。
本文将介绍氨基酸柱前衍生化方法的原理、步骤和应用。
一、原理
氨基酸柱前衍生化方法的原理是将氨基酸中的氨基或羧基与某种试剂反应，形成易于检测的衍生物。
常用的试剂有二氯苯胺、荧光素-5-异硫氰酸酯、乙酰氯等。
这些试剂与氨基酸反应后，可以形成具有荧光、紫外吸收或色谱检测等特性的衍生物，从而实现氨基酸的检测。
二、步骤
氨基酸柱前衍生化方法的步骤如下：
1.样品制备：将待测样品溶解在适当的缓冲液中，pH值一般为7.0-9.0。
2.衍生试剂制备：根据需要选择合适的衍生试剂，按照说明书制备。
3.衍生反应：将衍生试剂加入样品中，反应一定时间后，加入适当的溶剂，使反应液达到适当的浓度。
4.样品净化：将反应液通过柱层析或其他净化方法，去除杂质和未
反应的试剂。
5.检测：将净化后的样品注入色谱柱中，进行检测。
三、应用
氨基酸柱前衍生化方法广泛应用于食品、药品、生物医学等领域。
例如，在食品中，氨基酸柱前衍生化方法可以用于检测蛋白质含量、氨基酸组成等；在药品中，可以用于检测氨基酸药物的含量和纯度；在生物医学中，可以用于检测血液中的氨基酸含量和代谢物的水平等。
氨基酸柱前衍生化方法是一种简单、快速、灵敏的氨基酸分析方法，具有广泛的应用前景。
氨基酸分析原理和色谱条件
分析原理和色谱条件一、氨基酸分析的须知：（一）样品要求：样品应有代表性，固体样品必须过60目筛；液体样品需有一定的流动性；办固体状的样品要保证能在称量纸上不流动。
对不难采集并需要我们处理的样品，常规样品一般固体样品5克左右，液体样品15ml左右；对难以收集的样品（如：酶、肽等）液体样蛋白含量应大于300μg/ml，体积不少于4ml；固体重量应不少于500μg。
（二）自己处理样品的同学和老师，应根据自己的样品状态，严格按照本室要求样品的处理方法处理样品。
并讲处理好的样品在星期二下午3点前送到测试中心氨基酸分析室，处理好的样品要同时送两份（两个盛有蒸干样品的25ml小烧杯），并提供样品的蛋白质含量、称样量、定容体积、加0.02NHCl体积等有关数据。
（样品处理方法见本附件）。
（三）因氨基酸分析需要柱后（或柱前）衍生，分析时间长，所以对氨基酸分析的上机浓度要求严格。
请各位老师和同学无论是自己处理样品还是需要氨基酸分析室处理样品都应准确知道自己所测样品的蛋白含量（或氨基态氮含量）。
如果需要本实验室处理样品时，提供的蛋白质含量的误差应控制±5%。
如20%的蛋白含量，提供的数据应为（18-22）%。
（四）氨基酸分析室仪为学校所有需要氨基酸分析的同学和老师服务，为了保证仪器能长期处于良好的运行状态除了我们机台的工作人员的努力外，还需要各位同学和老师的大力合作。
样品的浓度过高极易造成分离柱的污染和反应盘管爆裂（每个反应盘管3000元左右）并且测定的数据也不准确；样品的浓度过低直接影响分析结果的准确性。
对提供的原始数据不准确的样品，在上机分析时造成仪器损坏或氨基酸峰过低由送样人员负责。
因提供原始数据不准确的样品需要重新上机的样品，则需另收上机费。
（五）氨基酸的分析需要柱前或柱后衍生，衍生化试剂对分析结果会有一定的影响，对需要做影响因素分析的样品，应妥善保管好不同时间采集样品，待样品收集全后，一起处理、一起做。
安捷伦--PICKERING柱后衍生操作手册
c. 打 开 钢 瓶 减 压 表 ， 调 节 出 口 压 力 为 3-5Bar ， 打 开 Gas Manifold的ON/OFF开关和加压试剂瓶的Vent阀，用惰性气体 Purge气体管线和试剂瓶。
事项。
二. 仪器配置:
在线脱气机(推荐使用) 二元泵或四元泵 自动进样器或手动进样器 柱温箱(可选) 荧光检测器 紫外检测器 化学工作站 Pickering 柱后反应仪 Pickering 氨基甲酸酯分析套包或氨基酸分析套包
三. 典型应用的分析方法
氨基甲酸酯分析
氨基甲酸酯类农药的结构中均含有下N-甲基氨基甲酰基，在USEPA方
法531.1中列出了十种分析物的结构式如下图（包含1-萘酚和内标 BDMC）。它们按照在C18柱上的流出顺序列出。除了1-萘酚外，它们 均含有N-甲基氨基甲酰基部分（用OR表示），甲萘威carbaryl(9)在 柱后反应器中也水解产生1-萘酚，注意从甲萘威carbaryl(9)水解产 生的1-萘酚与标样中的1-萘酚的保留时间不同，这对故障排除非常有 用。氨基甲酸酯的分离可通过Pickering 5u 25cm C18或C8柱在42℃ 或37℃下分离。
7. 打开PCX 5200的柱温箱，按照下图所示连接保护柱和分析柱。
8. 准备一瓶高纯N2，连接1/8英寸的铜质或SARAN管线到高压钢瓶的 减 压 表 上 ， 将 管 线 的 另 一 端 连 接 到 气 路 控 制 组 件 （ Gas Manifold）的入口，如下图所示：
氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用
在生物体内出现的氨基酸都是Ｌ型，而Ｄ型氨基酸仅在少数微生物来源的多肽中出 现［２，３１。
１．１．２．３根据酸碱性分类
根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同，可以将其分为酸性氨基酸、中性 氨基酸、碱性氨基酸。酸性氨基酸主要包括Ｇｌｕ、Ａｓｐ：碱性氨基酸主要有：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 Ｈｉｓ；其余基本氨基酸均为中性氨基酸。
Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｏｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｌｏ－ｐａｃｋｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎｓ，ｔｈｅ Ｌｉｎｋ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｍｏｄｅｌ ｏｆｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｃｋｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ５ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃ１８ ｐａｃｋｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ谢ｔｈ ＤＮＰ－ＡＡ．Ｉｔ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｋ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ Ｃ１８·－Ｂ ａｎｄ Ｃ１８··ＳＡ ｃｏｕｌｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐａｃｋｉｎｇｓ ｃｏｕｌｄ ａｃｈｉｅｖｅ ｂｅｔｔｅｒ ｐｅａｋ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．
为弥补单一色谱填料分离选择性的不足，通过对ＤＮＰ－ＡＡ在６种不同Ｃ１８填料 上分离行为的考察，发展了“串联”和“混装”的色谱柱模式。采用Ｃ１８．Ｂ与Ｃ１８．ＳＡ 串联的操作模式，可以使ＤＮＰ－ＡＡ的分离选择性得到较大改善。而以Ｃ１８．Ｂ和Ｃ１８．ＳＡ 填料混合装填色谱柱进行ＤＮＰ－ＡＡ的分离，所得峰形、柱效等更佳。
氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的应用
氨基 酸 的衍 生 化试 剂 的种 类 繁 多 ， 理 想 的衍 生 试剂 应在 很短 的时 间 内与 氨基 酸 形 成 稳 定 的 、 单一 的且 能反 映原 氨基 酸 结构 的产 物 ， 并 且 衍 生 反应 必 须操 作简 单 、 重 现性 高 ， 过量 的衍 生试剂 应该 不干 扰 以后 的色谱 分 离和 检 测 ， 或 者 在必 要 的情 况 下 很容 易 除去 。常用 的衍 生化 试剂有 如 下几种 。
口 腔 护 理 用 品 工 业
ＯＲＡＬ ＣＡＲＥ Ｉ ＮＤＵＳ ＴＲＹ
第二十 四卷第 四册
２ ０ １ ４年 ８月
氨 基 酸 柱 前 衍 生 ＨＰ Ｌ Ｃ分 析 方 法 的 应 用
康春 生 于 灏 汪发文 王辰旭 田彩天
（ 国家移动实验室研究发展与评价中心 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ３ ６ ）
３ 衍 生化 试剂
直是 分析领 域 研 究 的重 要 课 题 之 一 。 目前 ， 氨 基
酸 的分 析方法 很 多 ， 主要 有 高效液 相 色谱法 ， 毛细管
电泳法 ， 质谱 法 （ 包括气 一 质 谱法和液 一质谱法 ）
等 。氨 基酸 分析 仪法是 高效 液相 色谱 法 中最重 要 的 氨基 酸 分析方 法 ， 它操作简便 ， 无 需进 行 柱 前 衍 生 ，
就分 离 测定 了大 鼠脑 中 ５种 氨基 酸介 质 的含量 。在
但是设备要求专用 ， 因此成本较高 ， 应用范 围较窄。 相较于 其 它 方 法 而 言 ， 常 规 的高 效 液 相 色 谱 法
（ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ） 运 用常规 反 应装 置 ， 具有高效、 简便 、 快速 、
准确和价格低廉等优点 ， 已成 为一种较为理想 的检
柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量
㊀基金项目:山东省重点研发计划(Ｎｏ.２０１８ＧＳＦ１１８１３２)㊀作者简介:邓红英ꎬ女ꎬ研究方向:药学ꎬＥ－ｍａｉｌ:８４２６７１９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:李永贵ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:新药研发ꎬＴｅｌ:１３５０５４０２３９０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｇ－１２３０＠１６３.ｃｏｍ柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量邓红英１ꎬ张永文２ꎬ李永贵３ꎬ４(１.山东大学齐鲁医院药品调剂科ꎬ山东济南２５００１２ꎻ２.济南市中心医院药剂科ꎬ山东济南２５００１４ꎻ３.山东省药学科学院ꎬ山东省化学药物重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１ꎻ４.山东省药学科学院ꎬ山东省医用高分子材料重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１)摘要:目的㊀建立以２ꎬ４－二硝基氟苯为衍生化试剂ꎬ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中各氨基酸含量的方法ꎮ方法㊀采用ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８色谱柱ꎬ乙腈－水(６０ʒ４０)为流动相Ａꎬ乙腈－磷酸盐缓冲液(９ʒ９１)流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ检测波长３６０ｎｍꎬ柱温２７ħꎮ结果㊀复方氨基酸注射液中各氨基酸分离度良好ꎬ线性相关系数均大于０.９９８９ꎬ平均回收率均在９８％~１０２％之间ꎬＲＳＤ％均小于２％ꎮ结论㊀本方法可以用于复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸检测ꎮ关键词:柱前衍生ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯ꎻ复方氨基酸注射液ꎻ１８ＡＡꎻ含量测定中图分类号:Ｒ９２７.２㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０１－００２７－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０１.００６ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣａｆｔｅｒｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＤＥＮＧＨｏｎｇｙｉｎｇ１ꎬＺＨＡＮＧＹｏｎｇｗｅｎ２ꎬＬＩＹｏｎｇｇｕｉ３ꎬ４(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇꎬＱｉｌｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＪｉｎａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ)ｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)ｗｉｔｈ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＡｎＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎｗａｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｗａｔｅｒ(６０ʒ４０)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ(９ʒ９１)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ.Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ３６０ｎｍａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ２７ħ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｇｏｏｄ.Ａｌｌｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ０.９９８９.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ９８％ａｎｄ１０２％ｗｉｔｈＲＳＤｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ).Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎꎻ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅꎻＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎꎻ１８ＡＡꎻＤｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎ㊀㊀复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)是一种含有合成人体蛋白质所需要的１８种氨基酸与其他辅料配制而成的灭菌水溶液ꎬ临床上主要用于蛋白质摄入不足以及吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要患者的治疗ꎬ也常用于改善手术后患者的营养状况[１]ꎮ由于氨基酸具有高极性㊁低挥发性㊁大部分无强发色基团的特性ꎬ因此其分离和检测都较为困难ꎬ目前常用的检测方法有氨基酸分析仪检测法㊁离子色谱法㊁柱前衍生高效液相色谱(ＨＰＬＣ)法等ꎮ方法存在仪器昂贵㊁运行费用高㊁衍生物不稳定且有一定毒性㊁各组分分离效果差㊁样品检测时间长等诸多问题[２－７]ꎮ本研究建立了２ꎬ４－二硝基氟苯作为衍生化试剂[８－９]ꎬ高效液相色谱法检测复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸的方法ꎬ该方法分离效果好ꎬ且重现性稳定ꎮ１㊀仪器与试药１.１㊀仪器㊀高效液相色谱仪(ＬＣ－２０ＡＴ型泵㊁ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ型检测器ꎬＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ液相色谱数据工作站ꎬ日本岛津公司)ꎻＢＴ１２５Ｄ分析天平(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ)ꎻＰＨＳＪ－３Ｆ精密酸度计(上海雷磁仪器厂)ꎻ超纯水机(艾柯)ꎮ１.２㊀试药㊀门冬氨酸(批号:１４０６９１－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ谷氨酸(批号:１４０６９０－２０１２０３ꎬ纯度:１００％)ꎻ丝氨酸(批号:１４０６８８－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ甘氨酸(批号:１４０６８９－２０１６０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ苏氨酸(批号:１４０６８２－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ盐酸精氨酸(批号:１４０７８１－２００８０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ脯氨酸(批号:１４０６７７－２０１５０７ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ丙氨酸(批号:１４０６８０－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ缬氨酸(批号:１４０６８１－２０１２０２ꎬ纯度:９９.６％)ꎻ甲硫氨酸(批号:１４０６８４－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ胱氨酸(批号:１４０６３２－２００５０２ꎬ纯度:９９.３％)ꎻ异亮氨酸(批号:１４０６８３－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ亮氨酸(批号:１４０６８７－２０１５０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ色氨酸(批号:１４０６８６－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ苯丙氨酸(批号:１４０６７６－２００４０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸组氨酸(批号:１４０６９３－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸赖氨酸(批号:１４０６７３－２０１５０９ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ酪氨酸(批号:１４０６０９－２０１５１３ꎬ纯度:９９.８％)对照品均购自中国食品药品检定研究院ꎮ复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)(自制中试品ꎬ批号:２０１６０５０１㊁２０１６０５０２㊁２０１６０５０３)ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯(批号:２０１５１２２７１ꎬ纯度:９９.０％ꎬ成都艾科达化学试剂有限公司)ꎻ乙腈为色谱纯ꎻ碳酸氢钠㊁磷酸二氢钾㊁氢氧化钠㊁磷酸为分析纯ꎮ２㊀方法与结果[１０]２.１㊀溶液制备㊀配样溶剂:ｐＨ７.０磷酸盐缓冲液ꎮ混合对照品储备溶液:精密称取氨基酸对照品各适量ꎬ加水溶解ꎬ制成每１ｍＬ中含有门冬氨酸６２.４５μｇ㊁谷氨酸１８.８３μｇ㊁丝氨酸２５.１１μｇ㊁甘氨酸１９０.０２μｇ㊁苏氨酸６２.５０μｇ㊁盐酸精氨酸１２５.０２μｇ㊁脯氨酸２５.０８μｇ㊁丙氨酸５０.０６μｇ㊁缬氨酸８９.９５μｇ㊁甲硫氨酸５６.２５μｇ㊁胱氨酸２.６５μｇ㊁异亮氨酸８８.０５μｇ㊁亮氨酸１２２.１５μｇ㊁色氨酸２２.５０μｇ㊁苯丙氨酸１３３.２０μｇ㊁盐酸组氨酸６２.５２μｇ㊁盐酸赖氨酸１０７.５８μｇ㊁铬氨酸６.３０μｇ的混合溶液ꎮ混合对照溶液:精密量取混合对照品储备溶液２ｍＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ供试品溶液:精密量取复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴中ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ空白溶液:按处方称取除氨基酸外的各组分ꎬ加水配成空白对照溶液ꎮ精密量取空白对照溶液５０μＬ至１０ｍＬ量瓶中ꎬ照供试品溶液配制方法配制成空白溶液ꎮ２.２㊀色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相Ａ为乙腈－水(６０ʒ４０)ꎬ流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２)(９ʒ９１)ꎻ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ柱温２７ħꎬ检测波长:３６０ｎｍꎻ进样体积１０μＬꎮ梯度程序见表１ꎮ表１ 梯度洗脱程序表时间/ｍｉｎ流动相Ａ(％)流动相Ｂ(％)００１００２１５８５１２２４７６１４３１６９３２４１５９４０８０２０２.３㊀专属性试验㊀分别取 ２.１ 项下混合对照品溶液㊁供试品溶液及空白溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎮ记录色谱图及峰面积ꎮ试验结果表明ꎬ在本检测条件下ꎬ空白溶液对氨基酸检测无干扰ꎬ且１８种氨基酸分离良好(见图１)ꎮ２.４㊀定量限与检测限㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ加配样溶剂稀释ꎬ制成不同浓度梯度的溶液ꎬ按上述色谱条件进行测定ꎬ分别取各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎮ计算各氨基酸的定量限与检测限ꎮ２.５㊀线性试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照品储备溶液１㊁１.５㊁２㊁２.５㊁３ｍＬꎬ分别置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入对应比例的５％碳酸氢钠溶液与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液ꎬ摇匀ꎬ分别置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为线性试验溶液ꎬ分别取上述各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图及峰面积ꎬ以浓度Ｃ为横坐标ꎬ峰面积Ａ为纵坐标做线性回归ꎬ求得线性方程及相关系数ꎬ结果见表２ꎮ２.６㊀精密度试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液１０μＬꎬ注入液相色谱仪ꎬ连续进样６次ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ表明仪器精密度良好ꎮ２.７㊀溶液稳定性试验㊀取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ分别于０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４ｈ精密量取１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ说明混合对照品溶液２４ｈ内稳定ꎮ２.８㊀回收率试验㊀精密量取空白基质５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别加入１８种氨基酸对照品适量(约相当于处方量的８０％㊁１００％㊁１２０％)ꎬ照 ２.１ 项下供试品配制方法配制成回收率试验溶液ꎬ平行配制３份ꎮ依法测定ꎬ计算平均回收率及ＲＳＤꎬ结果见表３ꎮ㊀Ａ.空白溶液ꎻＢ.混合对照品溶液ꎻＣ.供试品溶液㊀１.门冬氨酸ꎻ２.谷氨酸ꎻ３.丝氨酸ꎻ４.甘氨酸ꎻ５.苏氨酸ꎻ６.盐酸精氨酸ꎻ７.脯氨酸ꎻ８.丙氨酸ꎻ９.缬氨酸ꎻ１０.甲硫氨酸ꎻ１１.胱氨酸ꎻ１２.异亮氨酸ꎻ１３.亮氨酸ꎻ１４.色氨酸ꎻ１５.苯丙氨酸ꎻ１６.盐酸组氨酸ꎻ１７.盐酸赖氨酸ꎻ１８.酪氨酸图１㊀ＨＰＬＣ图谱表２㊀各氨基酸组分线性方程㊁相关系数㊁线性范围㊁定量限与检测限名称线性方程相关系数线性范围/μｇ ｍＬ－１定量限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ３)检测限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ１０)门冬氨酸Ａ＝６９７７０Ｃ＋４７４０６０.９９９５６.２４５０~１８.７３５００.１２０.０４谷氨酸Ａ＝５７０５５Ｃ＋１１９２００.９９９２１.８８３０~５.６４９００.０９０.０４丝氨酸Ａ＝８７２１４Ｃ＋１３２０４０.９９９２２.５１１０~７.５３３００.０５０.０２甘氨酸Ａ＝１２４６０２Ｃ＋１７９５６８０.９９９６１９.００２０~５７.００６００.１３０.０３苏氨酸Ａ＝８２４５８Ｃ＋５４４３００.９９９６６.２５００~１８.７５０００.１３０.０４盐酸精氨酸Ａ＝４４７０８Ｃ＋５５２７００.９９９２１２.５０２０~３７.５０６００.２５０.０９脯氨酸Ａ＝６０９７５Ｃ＋１７５３５０.９９９４２.５０８０~７.５２４００.１３０.０５丙氨酸Ａ＝１０４７８０Ｃ＋５６３７７０.９９９４５.００６０~１５.０１８００.１００.０４缬氨酸Ａ＝５８３１４Ｃ＋５６３７７０.９９９４８.９９５０~２６.９８５００.１８０.０６甲硫氨酸Ａ＝６３８０３Ｃ＋３４２８７０.９９９２５.６２５０~１６.８７５００.２８０.１１胱氨酸Ａ＝１ˑ１０６Ｃ＋３４２８７０.９９９２０.２６５０~０.７９５００.１５０.０６异亮氨酸Ａ＝７２２６１Ｃ＋６６２９６０.９９９３８.８０５０~２６.４１５００.１８０.０６亮氨酸Ａ＝７１２５６Ｃ＋８９５９５０.９９９３１２.２１５０~３６.６４５００.２５０.０９色氨酸Ａ＝３４７７８Ｃ＋９０５１.７０.９９９１２.２５００~６.７５０００.３５０.１２苯丙氨酸Ａ＝５７５９９Ｃ＋７１０４６０.９９９５１３.３２００~３９.９６０００.２３０.０８盐酸组氨酸Ａ＝２４５４３４Ｃ＋７１０４６０.９９９５６.２５２０~１８.７５６００.６１０.１２盐酸赖氨酸Ａ＝２３３１８Ｃ＋４９２２３０.９９９７１０.７５８０~３２.２７４００.０８０.０２酪氨酸Ａ＝５４８７８Ｃ＋２３０４０.９９９１０.６３００~１.８９０００.９４０.３１表３㊀回收率试验结果名称平均回收率(％)ＲＳＤ(％)门冬氨酸９９.８００.７８谷氨酸１００.１９０.７９丝氨酸１０１.０９１.９３甘氨酸９９.５６１.３８苏氨酸１０１.２４１.４２盐酸精氨酸１００.１２１.０３脯氨酸９８.７３０.５２丙氨酸９９.９５０.６８缬氨酸９８.８７０.９９甲硫氨酸１００.３４１.３９胱氨酸９９.１６１.８２异亮氨酸９９.５８０.９２亮氨酸１００.２２１.８０色氨酸１００.０８１.４５苯丙氨酸９９.９３１.１７盐酸组氨酸９９.８０１.７０盐酸赖氨酸１００.２３１.２７铬氨酸９９.７７１.４０２.９㊀样品检测㊀取本品３批ꎬ照 ２.１ 项下方法制备混合对照溶液及供试品溶液ꎬ照 ２.２ 项下色谱条件检测各氨基酸含量ꎬ结果见表４ꎮ表４㊀样品测定结果名称含量(％)２０１６０５０１２０１６０５０２２０１６０５０３门冬氨酸９９.６８１００.２７１００.９９谷氨酸９９.１９９９.１５１００.１７丝氨酸１００.４３９９.５０１０１.５５甘氨酸９９.９５１００.０７１０１.３１苏氨酸１００.２９１００.４３１０１.８７盐酸精氨酸１００.５１１００.６０１０１.７８脯氨酸９９.６７１００.４８１０１.０１丙氨酸９９.６８１００.７２１０１.０２缬氨酸９９.７０９９.７０１０１.０３甲硫氨酸１００.２４１００.０８１０１.３０异亮氨酸１００.０６９９.０３９８.２９亮氨酸１０１.２３１０１.２９１０２.５４色氨酸９９.９７１００.８２１０１.２６苯丙氨酸１００.７９１０１.０５１０２.７９盐酸组氨酸９９.９４９９.８６１０１.４７盐酸赖氨酸１０１.４２１０１.１５１０１.１８酪氨酸１０１.１７１００.９５１０２.０５３ 讨论３.１㊀衍生化条件选择㊀本研究分别对衍生化试剂用量㊁衍生化温度及衍生化时间进行研究ꎬ结果使用１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ在６０ħ条件下衍生化１ｈꎬ样品中各氨基酸均能衍生化完全ꎬ样品检测重复性好ꎮ３.２㊀流动相研究㊀本研究流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２) (９ʒ９１)ꎬ９％的乙腈能防止流动相长菌㊁沉淀ꎬ延长流动相使用时间ꎻ磷酸盐浓度对氨基酸的分离效果有改善作用ꎻｐＨ值８.２要求选用耐碱色谱柱进行试验ꎮ３.３㊀柱温研究㊀本研究最佳柱温为２７ħꎬ研究发现柱温波动对色氨酸与组氨酸分离影响较大ꎬ当柱温在(２７ʃ１)ħ时ꎬ各氨基酸能较好地分离ꎮ３.４㊀本检测方法胱氨酸可以与其他氨基酸完全分离ꎬ但是由于其含量低ꎬ检测浓度接近定量限浓度ꎬ因此含量测定时未做计算ꎮ参考文献:[１]㊀李莉ꎬ崔红艳ꎬ钟佳琪ꎬ等.ＨＰＬＣ法同时直接测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中的蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜[Ｊ].分析实验室ꎬ２０１８ꎬ３７(１１):１３０９－１３１４.[２]谢升谷ꎬ胡楚楚ꎬ黄巧巧ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中焦谷氨酸的含量[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２０１５ꎬ３４(４):７０５－７０９.[３]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(二部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:８１１－８１２. [４]ＬＩＷꎬＨＯＵＭꎬＣＡＯＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ２０ｆｒｅｅａ￣ｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎａｓｐａｒａｇｕｓｔｉｎｂｙｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄａｆｔｅｒＰｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＡｎａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１２ꎬ５(１):６２－６８.[５]陈建秋ꎬ王玉红ꎬ李鹏ꎬ等.核壳液相色谱－蒸发光散射检测法直接检测２０种氨基酸[Ｊ].上海医药ꎬ２０１５ꎬ３６(１１):７５－７９.[６]陈丽梅ꎬ尚艳芬ꎬ赵孟彬ꎬ等.柱前衍生化－超高效液相色谱法快速测定酱油中的１８种氨基酸[Ｊ].色谱ꎬ２０１０ꎬ２８(１２):１１５４－１１５７.[７]万丹晶ꎬ陈妙芬ꎬ翟咏虹.用ＨＰＬＣ法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中１８种氨基酸[Ｊ].药学服务与研究ꎬ２００６ꎬ６(３):２１２－２１４.[８]楼永明ꎬ林敏ꎬ陈秀琳.ＨＰＬＣ测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)有关物质的初步研究[Ｊ].中国药品标准ꎬ２０１９ꎬ２０(１):３７－４１.[９]付宜和ꎬ杨国庆ꎬ龚道芬ꎬ等.２ꎬ４－二硝基氟苯柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液ＨＰＬＣ色谱条件的优化[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２００５ꎬ２５(７):７６２－７６４.[１０]李永贵ꎬ张锡霞ꎬ王晶ꎬ等.一次性使用无菌注射器中抗氧剂１０１０的迁移研究[Ｊ]生物医学工程研究ꎬ２０１６ꎬ３５(２):１３３－１３５.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DAD
wlo_^u=bÅäáéëÉJ^^^ QKS=ñ=NRM=ããI=R=µã mk=VVPQMMJVMO !" G wlo_^u=bÅäáéëÉJ^^^
2
4 6
7 58 8 1 7 1 6 10
9 12
13 10
mAU 3 2 1 0 -1 0
50 pmol
3 4 6 5 78
16
7 1 10 8 1 9 12
A
! PJjm^ !"# cjl`
262 nm
22 23
B
24
!"#$%&'()* cjl` !"#$% !"#$%
10
12
min
NPNP^
!"#$%&'() !"#$%&'
N !"Eclipse-AAA !"#$% 24 !" 4.6 x 75 mm, 3.5 µm !"#" 1 !A. 338 nm OPAB. 262 nm FMOC! "
!"#$%&'()* !"#$%&'()* TRJãã !"# !"# NQ NM ! ! !"#$%&' OS ! NS !"#$ emi` !"#$%&' ! !"#$ !"# NRMJãã ^ _
!"#
!$
!"# L
!"#$%&'()*+ !"#$%& !"#$%& !"#$% & !
!"#$ NNMM
!" !"#$ NRJÅãK RJµã= ! OSO=åã ! P^ !"#$% P` ON !" !"# !"# OO ! lm^ !"# ! !"# !"# PPU=åã !"#$%&'() !" cjl` OSOåã !" NNMM=a^a !"# OSO=åã= !"#$ !"#$%& jta !"#PPU=åã !"#$% R^ em=NMVM=emi` !" ^ãáåçnì~åí RVRQJSORT !"#$ R !"#$ ! ! !"#$ !"#$% !" em=NMVM=emi` ^jfklnr^kq $%&'()*+ !"# !"#$ ! !"# !"#$%&' ! !"#$%&' ( !" !"
mAU 5 0 mAU 10 5 0 LU 1000 500 0 0
338 nm
1 2
3 4 7 6 5 8
9 10 11 12
16 17 14 15 18 19 21 20 13
A
23 24
262 nm
22
B C
20 25 min
21
FLD
1
3 2 4 6 5
9 78 10 11 12
16 17 22 15 1819 20 14 21
mAU 8 6 4 2 0 mAU 12 8 4 0 0
338 nm
2 1
3
9 16 17 15 4 6 5 7 8 10 11 12 14 13 18 19 21 20
A
! NRM=ãã=wçêÄ~ñ=bÅäáéëÉJ ^^^ JJJPKR=µã !" lm^ PPU=åã PKRJµã !
262 nm
4
!
~åÇ=éÜÉLáäÉ
~ëéLÖäì
R=éãçä
RM=éãçä a^a U
!"#$ cia a^a
!" ^ãáåçnì~åí !"#$%&' ^ ée
!" !"#
!"#$%&'()*+,-
!"# !"# T
R_
wçêÄ~ñ=bÅäáéëÉJ^^^ !"#$ !"#$%& !" !"#$%&'
T
!"# ! "
2
!" lm^ N^ OSO=åã NOR=éãçi
! PPU=åã !" cjl` ! N_ ! !"#MKR=µi !"#$
mAU 8 4 0
1 2
3
9 16 17 18 1415 19 21 20 13
3.5 µm Zorbax Eclipse-AAA
4
78 6 5
10 11
12
23 24
5
10
15
!"#$%Zorbax Eclipse-AAA !" ! 4.6 x 150 mm, 3.5 µm !"#$# 1 (OPA ) B. UV 262 nm(FMOC), C. ( P
!"#$% A UV 338 nm !"#)
!" TRJãã N !" !" !"#$ O
!"#$ NRMJãã !"#$%& !"#$%&' R=µã !"# !"#$ (
NNMM=emi`
! "#$%&'()* N NNMM=emi` !"#$%& a^a !"#$%&'()* !"#$%&' !"# !" !&'(
!"#$%& J J J ^^ lm^ cjl` ! !" !
mAU 10 5 0 mAU 15 10 5 0 0 2 4 6 8
21 1 2 5 9
wçêÄ~ñ=bÅäáéëÉJ^^^ !"#$%&
^ãáåçnì~åí
!"#$%&'( NKMMMMM
!"#$%&'() bÅäáéëÉJ^^^ !"#$%&'
wlo_^u=bÅäáéëÉJ^^^=PKM=ñ=NRM ããI=EPKR=µãFI=OMMM !
5
mAU 3 2 1 0 -1
1 1 3 4
16
5 pmol
11 14
12 15 14 13 18 19 16 15 21 20
!"#$% NM=éãçä !"#$ cia U !"#$%&'()!*+, !"# !
!"#$%&'( ~ëéLÖäì
a^a
!"#$%&'()*+ em= NMVM bÅäáéëÉJ^^^ ^ãáåçnì~åí !"# !" ! !"# !" ASP GLU ASN SER GLN HIS GLY THR CIT ARG ALA TYR CY2 VAL MET NVA TRP PHE ILE LEU LYS HYP SAR PRO BêëÇ 0.58 0.33 0.16 0.12 0.12 0.11 0.15 0.12 0.10 0.36 0.11 0.12 0.17 0.16 0.17 0.15 0.18 0.14 0.14 0.18 0.19 0.13 0.14 0.12 0.18
P_ !"#$% !"#$%&' !"#$ !
! a^a !" !"# !
jta
!"#$%&'() *+, lm^ cjl` !"#$%&' !"NNMM=sta
!"#em
!"#$%&'() !"#$%&'()* !"#$%
~ëéLÖäìI=ÜáëLÖäóI=~ä~L~êÖI=î~äLãÉí
Asp/Glu
!"
emi`
!"#$
1
!" emi` !"#$
wçêÄ~ñ=bÅäáéëÉJ^^^
NNMM=emi` !"
John W. Henderson, Robert D. Ricker, Brian A. Bidlingmeyer, Cliff Woodward
!"#$%&'()* !"#$%&'()*+ !"#$%&'( emi` ! !"#$ lm^ VJ ! !"#$ "# cjl` !" !"# !" !"# !"
!"#$%& rs !"#$ !" OO P`
!"#$ !"#$ !"QRM ON !"# ! !"# !"# !"
mAU 40 30 20 10 0 mAU 8 6 4 2 0 0
His/Gly
Val/Met Ala/Arg
Phe/Ile
A
åã=Ebñ=Z=PQM=åãF
His/Gly Asp/Glu
P
Q
P=KRJµã=
!"#$%&'( ! cjl`J ! ! !"# !"#$%& =