PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定
柱前衍生HPLC法测定复方氨基酸注射液（20 AA）中氨基酸含量
柱前衍生HPLC法测定复方氨基酸注射液（20 AA）中氨基酸含量方方;纪宇【期刊名称】《中国药品标准》【年(卷),期】2016(0)1【摘要】Objective:To establish a new HPLC method for the determination of 18 kinds of amino acids , including asparagine and ornithine hydrochloride in Compound Amino Acid Injection (20AA).Methods: With γ-aminobutyric acid as internal standard , after pre-column derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate ( AQC) , 5μL of amino acids derivatives was injected and separated on a Kromasil C 18 column(4.6 mm ×250 mm,5 μm) with 140 mmol・ L-1 ammonium acetate buffer solution as mobile phase A and acetonitrile-water ( 57∶43 ) as mobile phase B , and detected at 248 nm.Results:18 kinds of amino acids derivatives showed good linearity ( r=0.994 7-0.999 7 ) in the range of 1.2-108.8 μg・ mL-1 .The average recoveries of high , middle and low concentration were 97.4%-103.1% with RSD of 1.3%-3.7%( n=9 ) , respectively.Conclusion:This method was convenient , accurateand superior to the working standard method .%目的：建立柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液（20AA）中包括门冬酰胺和盐酸鸟氨酸在内的18种氨基酸含量的方法。
柱前衍生高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中氨基酸的含量
柱前衍生高效液相色谱法测定灵芝孢子粉中氨基酸的含量殷娇阳1，阎 姝2，田书霞2摘要 目的：建立用于测定灵芝孢子粉中氨基酸含量的柱前衍生化高效液相色谱方法。
方法：采用邻苯二甲醛（OPA）和9-氯甲酸芴甲酯（FMOC）联用对灵芝孢子粉中的氨基酸进行衍生，色谱条件为：Advance Bio AAA（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相A为0.01 mol/L磷酸氢二钠和0.01 mol/L硼酸钠溶液，pH值为8.2±0.1，流动相B为甲醇︰乙腈︰水（45︰45︰10）。
流速：0.8 mL/min，柱温：45 ℃，进样量：10 μL，检测波长：338 nm和262 nm。
结果：灵芝孢子粉中检测的17种氨基酸在60 min内分离良好；在一定范围内线性关系良好(r≥0.999，n=6)；加样回收率为95.42%~99.38%，实验方法的精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（RSD）均小于3.0%。
结论：经方法学验证显示，本研究所建立的实验方法适用于灵芝孢子粉中17种氨基酸的含量测定。
关键词：灵芝孢子粉；高效液相色谱法；氨基酸；衍生化中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1007-6948(2021)02-0182-07doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2021.02.004Assay of Amino Acids in Ganoderma Lucidum Spore Powder by Pre-column Derivatization HPLC YIN Jiao-yang, YAN Shu, TIAN Shu-xia School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin (300070), China Abstract: Objective To establish a pre-column derivatization-high performance liquid chromatography method for the determination of amino acids in ganoderma lucidum spore powder. Methods The amino acids in ganoderma lucidum spore powder were derivatized with o-phthalaldehyde (OPA) and 9-fluorenylmethoxycarbonyl chloride(FMOC). The chromatographic conditions were Advance Bio AAA (100 mm×4.6 mm, 2.7μm) column, and Mobile phase A was 0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate and 0.01 mol/L sodium borate solution (pH: 8.2±0.1). Mobile phase B was methanol: acetonitrile: water (45:45:10), flow rate was 0.8 mL/min, the column temperature was 45 ℃, the injection volume was 10 μL and the detection wavelength was fixed at 338 nm and 262 nm. Results 17 amino acids in Ganoderma lucidum spore powder were separated satisfactorily in 60 minutes. All the components exhibited good linear correlation in the given concentration range (r≥0.999, n=6). The recovery rate of the sample was between 95.42% and 99.38%. The RSD of the precision, repeatability and stability of the experimental method were all less than 3.0%. Conclusion The methodological verification shows that the established experimental method is suitable for the determination of 17 amino acids in ganoderma spore powder.Key words: Ganoderma lucidum spore powder; HPLC; amino acid; derivatization灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，灵芝药用在我国已有几千年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品[1]。
氨基酸 hplc
氨基酸 hplc
氨基酸HPLC分析是指使用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对氨基酸进行分析的方法。
HPLC是一种分离和检测复杂混合物中特定成分的高效技术，广泛应用于生物、制药、食品和化工等领域。
氨基酸HPLC分析的原理是利用不同氨基酸在固定相和流动相之间的吸附、分配和疏水性等相互作用的不同，实现氨基酸的分离。
通过与标准品进行比较，可以确定不同氨基酸的种类和浓度。
在进行氨基酸HPLC分析时，通常需要将样品进行前处理，以去除杂质和提高分离效果。
常用的前处理方法包括柱前衍生化、溶剂萃取、固相萃取等。
其中，柱前衍生化是将氨基酸转化为可被HPLC检测到的衍生物，以提高检测灵敏度。
氨基酸HPLC分析具有高分离效能、高灵敏度和高分辨率等特点，可以同时分离多种氨基酸，并对其进行定性和定量分析。
此外，HPLC还可以与其他检测器联用，如紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器等，以提高检测灵敏度和选择性。
在实际应用中，氨基酸HPLC分析主要用于食品、生物制品、药品等领域的氨基酸分析。
例如，在食品工业中，可以用于检测食品中的氨基酸成分，以评估其营养价值和品质。
在生物制药领域，可以用于药物中氨基酸的含量测定和质量控制。
总之，氨基酸HPLC分析是一种高效、灵敏和准确的氨基酸分析方法，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，氨基酸HPLC分析将在更多领域发挥重要作用。
氨基酸柱前衍生HPLC分析方法的应用
氨基 酸 的衍 生 化试 剂 的种 类 繁 多 ， 理 想 的衍 生 试剂 应在 很短 的时 间 内与 氨基 酸 形 成 稳 定 的 、 单一 的且 能反 映原 氨基 酸 结构 的产 物 ， 并 且 衍 生 反应 必 须操 作简 单 、 重 现性 高 ， 过量 的衍 生试剂 应该 不干 扰 以后 的色谱 分 离和 检 测 ， 或 者 在必 要 的情 况 下 很容 易 除去 。常用 的衍 生化 试剂有 如 下几种 。
口 腔 护 理 用 品 工 业
ＯＲＡＬ ＣＡＲＥ Ｉ ＮＤＵＳ ＴＲＹ
第二十 四卷第 四册
２ ０ １ ４年 ８月
氨 基 酸 柱 前 衍 生 ＨＰ Ｌ Ｃ分 析 方 法 的 应 用
康春 生 于 灏 汪发文 王辰旭 田彩天
（ 国家移动实验室研究发展与评价中心 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ３ ６ ）
３ 衍 生化 试剂
直是 分析领 域 研 究 的重 要 课 题 之 一 。 目前 ， 氨 基
酸 的分 析方法 很 多 ， 主要 有 高效液 相 色谱法 ， 毛细管
电泳法 ， 质谱 法 （ 包括气 一 质 谱法和液 一质谱法 ）
等 。氨 基酸 分析 仪法是 高效 液相 色谱 法 中最重 要 的 氨基 酸 分析方 法 ， 它操作简便 ， 无 需进 行 柱 前 衍 生 ，
就分 离 测定 了大 鼠脑 中 ５种 氨基 酸介 质 的含量 。在
但是设备要求专用 ， 因此成本较高 ， 应用范 围较窄。 相较于 其 它 方 法 而 言 ， 常 规 的高 效 液 相 色 谱 法
（ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ） 运 用常规 反 应装 置 ， 具有高效、 简便 、 快速 、
准确和价格低廉等优点 ， 已成 为一种较为理想 的检
柱前在线衍生-HPLC内标法快速测定脑蛋白水解物注射液中的氨基酸
柱前在线衍生-HPLC内标法快速测定脑蛋白水解物注射液中的氨基酸冯辉;董祥君;吴焱;孙海侠【摘要】A HPLC for rapid determination of amino acids in cerebroprotein hydrolysate injection was developed. Norvaline was added to samples before preparation as internal standard. Then online derivatization with o-phthaldialdehyde(OPA) and 9-fluore-nylmethyl chloroformate( FMOC - Cl) was performed automatically by the autosampler, and analyzed on a C18 short column using gradient elution with diode array detector(for Iysine) and fluorescence detector(for other amino acids except lysine) combined detection. The analytical time was 14 min. The peak area of amino acids versus their concentration had a good linearity (correlation coefficients were 0.9987 -0.9999) in the range of 4.5 -900 μmol/L. Limits of detectio n (LOD) were in the range of0.032 -0.578 mg/L, limits of quantification (LOQ) were in the range of 0. 105 - 1.929 mg/L. The recoveries of standard spiking of 16 amino acids were in the range of 95.39% - 105.33%. The relative standard deviations(n =7) of intraday and interday were in the range of 1.95% -4.81% and 3. 14% -6.70% , respectively.%建立了利用高效液相色谱仪快速测定脑蛋白水解物注射液中氨基酸含量的方法.样品处理采用先提取后水解转化的方法,色谱分离使用反相C18分析柱二元高压梯度洗脱;使用二极管阵列检测器检测,波长为260 nm;分析时间为14 min.各氨基酸在4.5-900μmol/L范围内线性关系良好,相关系数为0.998 7-0.9999;检出限为0.032 -0.578 mg/L,定量限为0.105 -1.929 mg/L;16种氨基酸回收率为95.39% -105.33%,日内和日间分析的相对标准偏差(n=7)分别为1.95% -4.81%和3.14%-6.70%.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】5页(P29-33)【关键词】柱前在线衍生;高效液相色谱法;脑蛋白水解物注射液;氨基酸【作者】冯辉;董祥君;吴焱;孙海侠【作者单位】长春市产品质量监督检验院,长春,130012;山东科兴生物制品有限公司,济南,250200;长春市产品质量监督检验院,长春,130012;长春市产品质量监督检验院,长春,130012【正文语种】中文脑蛋白水解物注射液(cerebroprotein hydrolysate injection)是以健康猪脑(或牛脑)经酶水解制成的无菌制剂，主要成分是游离氨基酸和小分子多肽[1]。
柱前衍生化HPLC法测定藏药熏倒牛种子中15种氨基酸含量
柱前衍生化HPLC法测定藏药熏倒牛种子中15种氨基酸含量李运;张国强;高鹏;李红玉;景明;魏锋【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2022(31)4【摘要】目的:建立柱前衍生化HPLC法测定藏药熏倒牛种子中15种氨基酸的含量。
方法:供试品在一定量6 moL·L^(-1)盐酸中110℃水解6 h,与异硫氰酸苯酯进行衍生化反应。
采用CAPCELL PAK-C18(250 mm×46 mm,5μm)色谱柱,以80%乙腈溶液(A)-0056 moL·L^(-1)乙酸钠缓冲液(B)为流动相,梯度洗脱(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),流速为10 mL·min^(-1),检测波长254 nm,色谱柱温度40℃。
结果:15种氨基酸衍生物能够达到基线分离,在096~5856μg·mL^(-1)范围内线性关系良好,r≥09991,精密度、重复性、稳定性试验的RSD值分别小于273%、285%、289%,加样回收率介于952%~1044%之间,RSD值均小于246%。
经测定,3批熏倒牛种子中氨基酸总含量分别为164%、155%和108%。
结论:此法简便易行,可用于藏药熏倒牛种子中15种氨基酸的含量测定。
【总页数】5页(P48-52)【作者】李运;张国强;高鹏;李红玉;景明;魏锋【作者单位】兰州市食品药品检验检测研究院/甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心;兰州大学药学院;甘肃中医药大学药学院;中国食品药品检定研究院【正文语种】中文【中图分类】R284【相关文献】1.柱前衍生RP-HPLC法测定狗尾草种子氨基酸含量2.DNFB柱前衍生化RP-HPLC测定大黄种子氨基酸的含量3.异硫氰酸苯酯柱前衍生化HPLC法测定水牛角浓缩粉6种氨基酸的含量及特征图谱分析4.DNFB柱前衍生化RP-HPLC法测定氨肽素的氨基酸含量因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸
D0I：10.13822/ki.hxsj.2021007962化学试剂，2021,43(6),801〜805柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸许永「，黄丽佳一2，刘欣1,李晶「，宋春满"，杨光宇1,李雪梅1(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650106；2.昆明医科大学药学院，云南昆明650504)摘要:建立了柱前衍生-高效液相色谱检测新鲜烟叶中18种游离氨基酸的分析方法。
0.2g样品用5mL超纯水超声提取30min,过滤后取0.5mL滤液以异硫氰酸苯酯(PITC)衍生，以Waters SunFire C18色谱柱为分析柱，80%乙睛和0.1mol/L乙酸钠水溶液为流动相，梯度洗脱，在254nm处检测，外标法定量。
结果表明，18种氨基酸的线性范围为2~ 50wg/mL，定量限为0.03〜0.10mg/g,3个水平加标平均回收率在84.6%-105%之间，相对标准偏差为1.7%~5.5%-该方法简便快速，适用于新鲜烟叶中18种游离氨基酸的含量分析-关键词:柱前衍生;高效液相色谱;烟叶;游离氨基酸中图分类号：0652文献标识码：A文章编号：0258-3283(2021)06-0801-05Determination of Free Amino Acids in Fresh Tobacco Leaves by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization XU Yong1,HUANG Li-jia'，,LIU Xin,LI Jing',SONG Chun-man*1,YANG Guang-yu',LI Xue-mei (1.Technology Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming650106,China；2.School of Pharmacy,Kunming Medical University,Kunming650504,China),Huaxue Shiji,2021,43(6),801〜805Abstract:A method was developed for the determination of18free amino acids in fresh tobacco leaves by pre-column derivatiza-tion-high performance liquid chromatography.0.2g Sample was extracted by ultrasonication with5mL ultrapure water for30min, filtrated and then0.5mL of the filtrate was derived with phenyl isothiocyanate(PITC)and analyzed on a Waters SunFire C18 column with80%acetonitrile and0.1moL/L aqueous sodium acetate solution as mobile phase.Derivatives were detected at the wavelength of254nm and quantified with external standard method.The results showed that the linear ranges of18free amino acids were2~50wg7mL,and the limits of quantitation were0.03〜0.10mg/g,and the average recoveries of18free amino acids were in the range of84.6%-105%with relative standard deviations of1.7%〜5.5%.The method is simple and suitable for the analysis of18free amino acids in fresh tobacco leaves.Key words:pre-column derivatization；high performance liquid chromatography；tobacco leaves；free amino acids氨基酸是烟草中一类重要化合物，在烟草生长、调制、醇化、加工直至成品卷烟抽吸过程中,氨基酸与烟草中的还原糖发生非酶棕化反应,生成多种香味前体物质,某些氨基酸如苯丙氨酸还可以自身分解成香味化合物,对形成芳香的烟草香气和吸味有重要贡献［1］-因此，分析烟草中氨基酸含量，对烟草品质评价及卷烟配方设计等均有重要意义-烟草氨基酸的分析方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有离子色谱-脉冲安培检测法［2,3］和液相色谱-串联质谱法［4-6］。
HPLC柱前衍生法测定舒血宁注射液中四种氨酸的含量
高效液相色谱法、光谱分析法、毛细管电泳分析法、
[10]
色谱分析法等 。氨基酸分析仪分析时间长，设备要
[11]
求专用，具有一定的局限性 。衍生高效液相色谱
法，包括柱前、在柱、柱后衍生高效液相检测法。由
于在柱衍生必须配备搅拌装置，柱后衍生又存在反 应室死体积小,反应速率要快的缺点，现主要采用柱
[12]
前衍生高效液相色谱法分析氨基酸 。其优点是灵
HPLC 柱前衍生法测定舒血宁注射液中
*
四种氨酸的含量
1
1
2
1
3
4
5
1
陈 莹 ，李 晋 ，曹 君 ，何 俊 ，关秀伟 ，张 纲 ，李志刚 ，常艳旭
（１.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 ３００１９３；２.杭州师范大学材料与化学化工学院，
杭州 ３１００３６；３.河北神威药业有限公司，廊坊 ０６５２００；４.河北省中药注射液工程技术研究中心，
对照品均购自于中国食品药品检定所；醋酸钠（天
津市风船化学试剂科技有限公司）；三乙胺（天津市
光复精细化工研究所）；甲醇、乙腈为色谱纯（天津 市康科德科技有限公司）；实验用水为 Milli-Q 超纯 水（Millipore 公司，Mill-QⅡ型）；其余试剂均为分析 纯；30 批舒血宁注射液为河北神威药业股份有限公
谢过程中的重要物质，也是组成酶的重要物质 。近
年来，随着人们对舒血宁注射液的药效物质认识深
入，对其质量的研究也越来越受到关注。有学者测
定了舒血宁注射液中原型黄酮醇苷、银杏总黄酮
苷、5-
羟
甲
基糠醛
的
[7-9]
含量 ，然而有
关
舒血宁注射
液中氨基酸的含量还未见报道。
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PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值 一． 前言 目前，氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC。随着HPLC的发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展。HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。HPLC检测氨基酸时，使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物，不同的衍生物所需色谱条件也有差别。查阅相关的研究报告，所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。每种方法各有自己的优缺点，应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择，最后选择异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。
二．准备工作 主要设备和试剂 1. 氨基酸分析专用柱（4.6×250，5um）1支 Agela公司 2. 高效液相检测仪 1台 安捷伦 3. 十八种氨基酸 1套 中检所 4. 异硫氰酸苯酯 10瓶 Agela公司 5. 三乙胺 2瓶 Agela公司
试剂配制 1. 三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6ml，混匀。 2. 异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2ml，混匀。 4℃ 3天 3. 流动相A：称取三水醋酸钠25.3g（或无水醋酸钠15.2g），加水1400ml，用冰醋酸调节pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。 4. 流动相B：80%乙腈，0.45um有机膜过滤。 5. 氨基酸标准贮备液 中检所十八种氨基酸，105℃3小时。使用十万分子一天平。
天冬氨酸 约32mg 133.10 谷氨酸 约35 mg 147.13 甘氨酸 约20 mg 75.07 脯氨酸 约30 mg 115.13 酪氨酸 约45 mg 181.09 胱氨酸 约30 mg 240.30 异亮氨酸 约30 mg 131.11 亮氨酸 约35 mg 131.11
半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。 衍生方法 取标准品（样品）0.2ml，加100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml，加1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下层清液过滤后进样。
三．实验部分 1.色谱条件选择 1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。用以下3个方法进行检测。从而确定最佳洗脱条件。
方法1 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 4 3 16 11 17 21 32 34 34 100 38 100 38.01 0 45 0
方法2 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 11 7 13.9 12 14.0 15 29.0 34 29.1 100 37.0 100 37.1 0 45.0 0 方法3 流速：1ml/min 检测波长：254nm 柱温：40℃ 进样体积：2ul 洗脱梯度： 时间 B％ 0 0 4 0 31 25 41 80 45 80 45.1 0 50 0
1.2 根据实验结果，确定最佳洗脱条件后，更改进样量为1ul。从而确定进样量的改变是否影响检测。 1.3 在WS-10001-（HD-0903）-2002规定用0.02mol/L盐酸溶液，但是考虑到某些氨基酸在0.02mol/L盐酸中不溶，所以改成0.1 mol/L盐酸溶液。为考察pH是否有影响，所以根据先前实验结果，确定最佳洗脱条件后，进行以下实验。 ①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。 ②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml0.1mol/L盐酸溶液后加水至刻度。 ③精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加水至刻度。 1.4 WS-10001-（HD-0903）-2002中规定使用外标法，但由于氨基酸分析过程比较复杂，影响因素较多，而且取样量比较少。查阅欧美药典，发现氨基酸分析中采用内标法以减少分析误差。 内标溶液1：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至250ml。 内标溶液2：称取正亮氨酸10mg，加0.1mol/L盐酸溶解至100ml。 ①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L）进样一针。 ②精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）进样一针。 2.检测方法学验证 通过色谱条件选择后，能确定最佳的检测条件，然后进行以下检测方法学验证。 2.1线性 内标溶液：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至100ml。 ①精密量取1ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加1ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（50pmol/L） ②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L） ③精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L） ④精密量取6ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加6ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（300pmol/L） ⑤精密量取8ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加8ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（400pmol/L） 2.2重现性 精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）（分别衍生6次） 2.3稳定性 精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L） 分别于0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、24小时进样。 四．结果汇总 1.1色谱条件选择 ①根据实验情况和液相图谱，方法3的梯度洗脱简单，基线相对平稳。 ②进样量的改变会影响氨基酸的峰形，进样量改为1ul时，不易产生拖尾等现象。 ③稀释氨基酸标准贮备液的溶剂改变（即改变标准品溶液pH），不会影响标准品的出峰时间和峰形。 ④α—氨基丁酸为内标，该内标物的衍生物位于脯氨酸衍生物和酪氨酸之间，分离度较大。但是，正亮氨酸的衍生物位于亮氨酸衍生物之后，易与亮氨酸重合。 1.2线性 根据实验情况，各氨基酸的R2如下： 天冬氨酸 谷氨酸 甘氨酸 脯氨酸 α-氨基丁酸 胱氨酸 酪氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 0.9930 0.9385 0.9094 0.9459 0.9337 0.9452 0.9361 0.9423 0.9411 1.3重现性（RSD） 天冬氨酸 谷氨酸 甘氨酸 脯氨酸 α-氨基丁酸 胱氨酸 酪氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 5.8% 5.8% 4.2% 3.9% —— 3.6% 2.8% 2.5% 2.6% 1.4稳定性 根据实验情况，发现在4小时候所进样品，在色谱图约7分钟有一个非常明显的杂质峰出现，同时半胱氨酸主峰逐渐减小，此现象随时间的增加越明显。 五．实验讨论 1.WS-10001-（HD-0903）-2002中规定使用外标法，但由于氨基酸分析过程比较复杂，影响因素较多，而且取样量比较少，因此在氨基酸分析中采用内标法以减少分析误差。常用的氨基酸分析内标有：α－氨基丁酸（AABA）；正亮氨酸（Nle）。 2.中检所十八种氨基酸，105℃3小时便于去除水分。半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸。胱氨酸在0.1mol/L盐酸中能溶解。各氨基酸在低浓度时稳定性稍差，不宜长期保存，应现配现用。 3.加入正己烷对过量的衍生物和副产物进行清除，以保护色谱柱。取下层清液过滤后进样，若下层清液无可见微粒，亦可不滤，将进样器针头插入溶液底部吸取。氨基酸和PITC反应形成的衍生物建议保存不超过3小时。 4.实验前一天配制流动相。100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液；1mol/L三乙胺乙睛溶液。 中午左右开始处理样品，封口后及时进行加热，便于第二日能够在早上水解完毕。标准品在105℃干燥3小时后，放入干燥中保存。 配制内标溶液。 5．实验当天，开启液相进行平衡。取出样品放冷，转移至蒸发皿中，蒸发至干。趁蒸发的时间，配制标准品，衍生等工作。趁衍生的时间配制样品。标准品衍生完成后，走液相。趁标准品走液相的时候，把样品进行衍生。注意：不可以一下衍生太多样品，因为超过4小时后，衍生物开始不稳定，特别是半胱氨酸。所以应逐步分批衍生样品。 6.标准品称取1个，衍生2份，各进样3针，计算平均及RSD%。RSD%≤9%实验成立，否则实验无效。再依次进样品1针。 7.实验完毕，冲洗机器，保存柱子。清洗器皿等。 8.异亮氨酸和亮氨酸在称量时稍微多称2mg，因为会粘在称量纸上的。 六．最终缩宫素氨基酸比值测定方法 1.溶液配制 1.1三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6ml，混匀。 1.2异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2ml，混匀。 4℃ 3天 1.3流动相A：称取三水醋酸钠25.3g（或无水醋酸钠15.2g），加水1400ml，用冰醋酸调节pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。 1.4流动相B：80%乙腈，0.45um有机膜过滤。 1.5内标溶液：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至100ml。 1.6氨基酸标准贮备液