Fmoc柱前衍生法测定氨基酸
高效液相色谱柱前衍生化法测定不同产地灵芝中氨基酸的含量
高效液相色谱柱前衍生化法测定不同产地灵芝中氨基酸的含量朱龙平1苗慧1陈建文1（1.中山大学药学院，广东广州5100062.）摘要：有关灵芝中氨基酸含量测定的报道相对较少，且大多数都是用氨基酸分析仪来测定。
本方法用异硫氰酸苯酯为衍生化试剂，处理灵芝样品后用高效液相色谱法测定了不同产地灵芝中六种氨基酸的含量，方法简便可靠，适用于灵芝中氨基酸含量的测定。
关键词：灵芝，高效液相色谱法，柱前衍生化，氨基酸灵芝又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝（G．lucidum·karst）和紫芝（G．japonicrn L loyd）的总称。
灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍惜药材，具备很高的药用价值，现代药理学研究证实，灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。
市面上灵芝类保健品种类繁多，目前国内的每年销售额约十几亿元人民币。
笔者对无限极（中国）公司提供的不同产生的灵芝样品中氨基酸含量进行分析，为更好的利用灵芝提供一些参考。
1实验部分1.1仪器：岛津LC-20A高效液相色谱仪，梅特勒AG285分析天平。
1.2试药灵芝，无限极（中国）有限公司提供，产地如下：经中山大学药学院生药学教研室杨得坡教授鉴定为多孔菌科灵芝属真菌紫芝（G．japonicrn L loyd）。
，氨基酸对照品门冬氨酸，谷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸。
色谱纯乙腈（百灵威），异硫氰酸苯酯（阿拉丁），三乙胺，正己烷等均为分析纯，高纯水实验室自制。
2.实验方法与结果2.1色谱条件色谱柱为venusil Mp柱（250mm×4.6mm，5u m），流动相A为0.1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（93:7），流动相B为乙腈-水（8:2）流速为1ml/min梯度洗脱，柱温箱40℃，进样体积2uL，检测波长254nm。
洗脱梯度见表1表1流动相洗脱梯度t（min）A（%）B（%）0 100 013 93 723 77 2329 65 3535 60 4040 0 10045 0 10047 100 02.2对照品溶液分别精密称取缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等对照品约6.0mg，置5ml容量瓶中用纯水稀释并定容至刻度。
柱前衍生_高效液相色谱快速测定皮革和头发水解液中的氨基酸
Abstract Ob jec tive : T o deve lo p a fast H PLC m ethod for deter m ining 17 comm on am ino acids in hydro ly sate o f leather and ha ir . M ethods : Am in o acids w ere separated on D ionex A ccla i m C18 ( 4 . 6 mm
-1
150 mm, 5 m ) co lu mn
w ith in 32 m in using 140 mm o l L sod ium acetate buffer so lution at pH 4 . 45 and 4 . 95 for grad ien t elution w ith acetonitrile- w ater( 60 40 , v /v ) and UV for detection after derivatization w ith A ccQ T ag derivatization reagen. t Re sults : The RSDs( n = 5) of retention t i m e and peak area of all am in o ac id sw ere less than 1 . 1 % and 5 . 0% , respec t iv e ly. T he li m it of detect io n( S /N = 3) w as in th e range o f 2 . 92- 4 . 51 pm o,l the linear range w as in the range o f - 1 - 1 2 2 . 5- 500 m o l L ( 1 . 25- 250 m o l L for cystine) w ith R 0 . 998 . T he spiked recovery of leather and ha ir w ere in the range of 80 . 1 % - 102 . 3 % and 85 . 3% - 103 . 2 % , respect iv ely. Conclusion: T he m ain advantages of the m ethod are si m p lified for the preparatio n o f m ob ile phase , cost sav in g , h ig h speed and less m atrix in terfer ence . It can be used for am ino acids deter m in ation in hydro ly sate of leather and ha ir effective ly . K ey w ord s : a m ino ac id s ; H PLC; pre- co lum n derivatizatio n ; leather ; hair 随着现代皮革工业的发展, 皮革化工材料及制 革理论都不断向现代化迈进 , 由于生皮的主要组成 是蛋白质, 整个制革过程离不开对蛋白质的研究, 氨 基酸是构成蛋白质的基本单元 , 因此分析氨基酸可 对蛋白质与皮化材料的相互作用作深入研究 , 从而 可推动现代皮革工业的快速发展。而毛发是提取各 种天然氨基酸的原料, 因此对皮革与毛发中氨基酸
高效液相检查醋酸奥曲肽氨基酸比值的方法学研究
１仪器 与试药
由结果 可知：各氨基酸色谱峰 间分离度均 大于 １．５，能够有效分
Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高效 液相色谱仪 ；ＭＳ１０５型精密 电子天平 （梅特 离，专属性 良好 。
勒）；磺基丙 氨酸（５０ｒａｇ，批 号 １４０７９４—２０１００１，中检 院）、苏氨酸（１００ｒａｇ， ２．４定 量限考察
衍 生 剂 ：ＯＰＡ 、ＦＭＯＣ
究 有 一 定 的 参 考 意 义 。
２．２ 检 查 方 法
参 考 文 献
取本 品 ｌｍｇ，置一玻璃管 中，加 ３０％过 氧化氢溶 液 一甲酸（１：９） ｆ１１高效液相 色谱 法．中国药典 ２０１５年版 四部 ５９．
１００ ｌ，置冰水浴 中 ４小时 ，真空干燥 ，加 ６ｍｏｌ／Ｌ盐 酸溶 液 １００ ｌ，充 ｆ２１醋酸奥曲肽质量标准．中国药典 ２０１５年版二部 １５４４—１５４５．
根据拟定 的醋酸奥 曲肽的反相高效液 相色谱法（ＲＰ—ＨＰＬＣ）氨基酸 比 ２．３专属性
值检查方法，进行 了方法学研究，为 醋酸奥曲肽 的进一 步研究 提供了 将各对照氨基酸分别配制成溶液，进行 氨基酸位置定位 。分别测
可靠 的分析方法及理论依据。
定各氨基酸溶液 、对照品溶液 与供试品溶液 。
曲张出血 。ｂ．预 防胰腺术后并发症 。ｃ．类癌综合征的类癌瘤。ｄ．经手 规 定 ：半 胱氨 酸 １．７－２．３，苏 氨 酸 ０．８一１．２，苯丙 氨 酸 １．８ ２．２，赖氨 酸
术 、放射治疗或多巴胺受 体激 动剂 治疗 失败 的肢 端肥 大症 等。本文 ０．９—１．１，应能检 出苏 氨醇 。
１０ｍｏｌ／Ｌ、氢氧化钠溶液调 ｐＨ至 ７．８。
表 ２
流动相 Ｂ： 乙腈 ：甲醇：水 （４５：４５：１０ Ｖ厂、，，ｖ）。 检测 波长： １－１５ｍｉｎ３３８ｎｍ ，１５—２６ｍｉｎ２６２ｎｍ
氨基酸含量分析法
新增附录附录XX 氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。
根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。
进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。
蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。
本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。
不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。
由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。
在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。
在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。
第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
本方法的线性浓度范围为0.025～1.25µmol/ml。
试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
柱前衍生高效液相色谱测定小儿复方氨基酸注射液中氨基酸
果表 明 ， 温 度 的升高有 利于 样 品衍 生完 全 ， 但 过 高会增 加副 产物 ， 以６ Ｏ ｜ Ｃ为最 佳 。
小儿 复 方氨基 酸 注射 液是 一种 含 有 较 高 浓 度 的小 儿 必 需 氨基 酸 的 产 品 。根 据 小 儿肝 酶 系统 的特 殊 性， 增 加 了酪 氨酸 含量 ， 含 有一 定量 的胱 氨 酸及 与ｆ ｌ ， Ｊ Ｌ 生 长 发育 关 系密 切 的牛磺 酸 。复方 氨基 酸 注射 液可
效评 价其 质量 提供 依据 。
１ 实 验 ｅ ｒ ｓ ５ １ ５二 元高 压 高效 液相 色谱 仪 ， 配备 ２ ９ ９ ６二 极 管 阵列 检 测 器 ， Ｐ Ｃ Ｍ 泵 控制 器 ， Ｅ ｍｐ ｏ ｗｅ ｒ 工 作
软件 ， 柱 温箱 ， ７ ７ ２ ５ ｉ 手动 进样 器 （ ２ Ｏ Ｉ 定量 环 ） 。
过滤 ， 得供试 品溶 液 。另取 １ ４种 氨基 酸标准 品适 量 ， 精 密 称定 ， 配 成 与供 试 品 溶 液浓 度 相 当 的溶 液 ， 以相
同方 法衍生 ， 作为 对照 品溶 液 。
取 对照 品溶液 和供试 品溶液各 ２ Ｏ Ｌ ， 分 别注 入液 相色谱 仪测 定 ， 按外标 法 以峰 面积计 算含 量 。
表 １ 流 动相 梯 度 洗 脱 程 序
Ｔａｂ ｌ ｅ １ Ｇｒ ａ ｄｉ ｅ ｎ ｔ ｅ ｌ ｕｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｂｉ ｌ ｅ ｐｈ ａ ｓ ｅ
OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用
流动相梯度：
时间(min) 0.0 12.0 15.0 30.0 35.0 38.0 49.0 52.0
流动相B（%） 0 22 22 70 70
100 100
0
流速（ml·min-1） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.0
每次实验前 要根据实际 情况，对梯 度进行微调
样品配制
单位： mg/mL
试验注意事项
流动相PH值必须精确调节至7.20±0.05
PH值 ，这样才能保证试验的可重复性
试验开始前，各泵一定要用纯水过度，
泵
特别是B泵（有机相），避免流动相中盐
的析出而损坏泵
衍生 试剂
衍生试剂稳定性较差，长时间放置后会 氧化变质，色谱峰增多，干扰检测。一 般在4℃下可以保存1周左右
OPA-FMOC联用柱前衍生化法
1986年惠普/安捷伦将OPA和FMOC衍生反应依次 结合，实现了氨基酸的全自动衍生、色谱分离和 检测。
让样品先与OPA试剂充分反应，将一级氨基酸全部 反应完全，接着样品中剩余的二级氨基酸再与 FMOC反应。
由于FMOC、FMOC衍生物和反应副产物比任何 OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何 一级氨基酸的检测。
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从4号瓶吸取1uLOPA试剂
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前在线衍生-HPLC内标法快速测定脑蛋白水解物注射液中的氨基酸
柱前在线衍生-HPLC内标法快速测定脑蛋白水解物注射液中的氨基酸冯辉;董祥君;吴焱;孙海侠【摘要】A HPLC for rapid determination of amino acids in cerebroprotein hydrolysate injection was developed. Norvaline was added to samples before preparation as internal standard. Then online derivatization with o-phthaldialdehyde(OPA) and 9-fluore-nylmethyl chloroformate( FMOC - Cl) was performed automatically by the autosampler, and analyzed on a C18 short column using gradient elution with diode array detector(for Iysine) and fluorescence detector(for other amino acids except lysine) combined detection. The analytical time was 14 min. The peak area of amino acids versus their concentration had a good linearity (correlation coefficients were 0.9987 -0.9999) in the range of 4.5 -900 μmol/L. Limits of detectio n (LOD) were in the range of0.032 -0.578 mg/L, limits of quantification (LOQ) were in the range of 0. 105 - 1.929 mg/L. The recoveries of standard spiking of 16 amino acids were in the range of 95.39% - 105.33%. The relative standard deviations(n =7) of intraday and interday were in the range of 1.95% -4.81% and 3. 14% -6.70% , respectively.%建立了利用高效液相色谱仪快速测定脑蛋白水解物注射液中氨基酸含量的方法.样品处理采用先提取后水解转化的方法,色谱分离使用反相C18分析柱二元高压梯度洗脱;使用二极管阵列检测器检测,波长为260 nm;分析时间为14 min.各氨基酸在4.5-900μmol/L范围内线性关系良好,相关系数为0.998 7-0.9999;检出限为0.032 -0.578 mg/L,定量限为0.105 -1.929 mg/L;16种氨基酸回收率为95.39% -105.33%,日内和日间分析的相对标准偏差(n=7)分别为1.95% -4.81%和3.14%-6.70%.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】5页(P29-33)【关键词】柱前在线衍生;高效液相色谱法;脑蛋白水解物注射液;氨基酸【作者】冯辉;董祥君;吴焱;孙海侠【作者单位】长春市产品质量监督检验院,长春,130012;山东科兴生物制品有限公司,济南,250200;长春市产品质量监督检验院,长春,130012;长春市产品质量监督检验院,长春,130012【正文语种】中文脑蛋白水解物注射液(cerebroprotein hydrolysate injection)是以健康猪脑(或牛脑)经酶水解制成的无菌制剂，主要成分是游离氨基酸和小分子多肽[1]。
柱前衍生化法测定丽江产玛咖中18种氨基酸含量
柱前衍生化法测定丽江产玛咖中18种氨基酸含量目的测定丽江产玛咖中必需氨基酸的含量。
方法以2，4-二硝基氟苯为衍生试剂，与丽江产玛咖中18种氨基酸柱前衍生，用Waters 600高效液相色谱仪，菲罗门公司Symmetry C18色谱柱，以含1% N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH=6.4）及乙腈∶水（1∶1）进行梯度洗脱，检测波长为360nm，柱温为35℃，进样量为20μL。
结果18种氨基酸的线性回归方程r值为0.9995～1.0000（n=5），平均回收率为99.54%～101.84%，RSD值为0.38%～1.82%，n=6。
结论本法快速、简便，结果准确。
标签：柱前衍生化；玛咖；氨基酸；2，4-二硝基氟苯；高效液相色谱法Maca（lepidium meyenii walp.，一般音译为“玛咖”）是十字花科（cruciferae）独行菜属（lepidium）一年生或两年生的草本植物，原产于秘鲁海拔3500～4000m 左右的胡宁（Junin）和帕斯克（Pasco）狭长地带[1]。
玛咖在南美的食用历史已经有5800多年，传统上作为食物和草药，可改善性功能[2]，提高生育力，抗疲劳[3]，抗肿瘤和用于治疗抑郁症、哮喘症和女性更年期综合征等。
玛咖中含有丰富的蛋白质、氨基酸、牛磺酸、矿物质锌[4]等与免疫调节相关的化学成分，而且传统上玛咖就具有显著的增强精力的“适应原样作用”[5]。
目前，以玛咖为原料的保健食品、食品日益增多[6]，但鲜有相关质量控制方法方面报道，氨基酸作为其保健主要成分，建立成熟的氨基酸测定方法，可为玛咖鉴别、质量控制、商品规格划分提供参考。
大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行衍生化。
目前已经报道的用于氨基酸柱前衍生的衍生试剂有多种[7-12]，不同的衍生剂都有各自的不足，而2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化方法因其试剂价格低廉，操作简便，所得产物相对稳定等优点而被广泛应用，本实验参考文献[13-14]采用该方法柱前衍生化测定丽江玛咖中总氨基酸类成分，同样考察水解因素及衍生化因素对结果的影响，有望为建立玛咖药材质量控制方法提供理论依据。