生物技术微生物学实验讲义

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微生物学实验一微生物制片及形态观察

实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。

显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。

光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。

图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。

焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。

油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。

目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。

聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。

聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。

显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。

一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。

有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。

2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

微生物学实验讲义

实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。

2.了解其他灭菌方法。

二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。

其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。

2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。

3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。

4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。

当压力降到零后，才能开盖。

五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。

二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。

2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。

微生物学实验ppt课件

器材与试剂的选用原则
03
如无菌操作、适用性、经济性等
02
细菌形态与结构观察
细菌培养及形态特征
01
02
03
细菌培养方法
包括需氧培养、厌氧培养和兼性厌氧培养等，不同种类的细菌需要不同的培养条件。
细菌菌落特征
观察细菌在固体培养基上形成的菌落，了解其形状、大小、颜色、透明度等特征。
细菌细胞形态
05
微生物代谢活性测定
生长曲线测定方法
直接计数法
通过显微镜直接观察并计数微生物数量，适用于较大微生物如细菌、酵母菌等。
比浊法
利用微生物生长引起培养液浊度变化来测定生长曲线，操作简便但易受杂质干扰。
平板菌落计数法
将待测样品稀释后涂布于固体培养基表面，培养后计数形成的菌落数，适用于可形成菌落的微生物。
原理
病毒必须寄生在活细胞内才能增殖，通过提供适宜的细胞环境，使病毒在细胞内复制并产生子代
病毒。
病毒检测技术及应用
免疫学方法
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等检测病毒抗原或抗体。
分子生物学方法
基于病毒核酸的特异性，利用PCR、实时荧光定量PCR等技术扩增并检测病毒核酸。
微生物学实验ppt课件
contents
目录
• 实验基础知识 • 细菌形态与结构观察 • 真菌形态与结构观察 • 病毒培养与检测技术 • 微生物代谢活性测定 • 微生物遗传与变异研究 • 微生物生态学及环境因子影响研究
01
实验基础知识
微生物学概述
类生活中的作用：如生态平衡、发酵工业等
生理生化鉴定
利用真菌的生理生化特性，如营养需求、代谢产物等，进行进一步的分类鉴定。

高中生物选修1《生物技术实践》课件2.1微生物的实验室培养

1．连一连
2．判一判 (1)培养基中碳源物质不可能同时是氮源。( × ) 解析：有些碳源可同时是氮源。
(2)培养基中只要有碳源、氮源、无机盐和水就能满足微生物的生长需要。( × )
解析：培养基中一般含有碳源、氮源、无机盐和水，但对于某些微生物来说，还需要特殊营养物质才能满足其生长需要。
(3)液体培养基含有水，而固体培养基不含水。( × ) 解析：液体培养基与固体培养基都含有水，它们的区别为是否添加凝固剂。
(3) 平板划线法：通过 _接__种__环___ 在琼脂固体培养基表面连续 ___划__线___的操作，将聚集的菌种逐步__稀__释____分散到培养基的表面。其具体操作是：
①将__接__种__环__放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 ②在火焰旁冷却__接__种__环__，并打开棉塞。 ③将试管口通过_酒__精 ___灯__火__焰__。 ④将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。 ⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 ⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条__平__行____线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
质配成)
工业生产分类、鉴定
用途
选择培养基鉴别培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中
加入高浓度食盐)
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或
3．消毒和灭菌
消毒
灭菌
概念
使用较为 __温__和____ 的物理或化学方法杀死物体 _表__面_____ 或内部的部分微生物(不包括 __芽__孢__和__孢__子__)

《微生物技术大实验》实验指导

《微⽣物技术⼤实验》实验指导《微⽣物技术⼤实验》实验指导（适⽤专业：11级本科⽣物技术微⽣物学⽅向）柯野编韶关学院英东⽣命科学学院2014年实验⼀、重组毕⾚酵母发酵表达蛋⽩酶及其初步鉴定⼀、实验⽬的1、学习重组毕⾚酵母培养基产物表达的⽅法。

2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。

3、学习表达的重组蛋⽩酶的鉴定及其酶活的测定。

⼆、实验内容1、毕⾚酵母的菌体⽣长和诱导表达的培养基的制备。

2、重组毕⾚酵母⽣长菌体曲线的测定。

3、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达。

4、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。

5、SDS-PAGE鉴定重组蛋⽩酶。

三、实验原理蛋⽩酶是催化蛋⽩质化合物中肽键⽔解为⼩肽或氨基酸的⼀类酶总称，⼴泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微⽣物中，并且对⽣物体的⽣理调控、催化各种代谢反应等⽅⾯具有重要的作⽤。

蛋⽩酶是⼀类重要的⼯业⽤酶，约占整个⼯业⽤酶量60%以上；⼴泛应⽤于⾷品加⼯、⽪⾰、医药和化⼯等⾏业。

由于蛋⽩酶具有⼴泛的⼯业、⾷品和医药等⽅⾯的应⽤价值，⽬前⼯业上需求量⼤。

植物中提取的蛋⽩酶主要是中性蛋⽩酶。

植物蛋⽩酶⽣产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、⽓候等多因素的影响致使来源不稳定。

动物源性蛋⽩酶多从⽜、⽺和猪等的胰脏中提取⽽得。

动物来源蛋⽩酶⽣产成本较⾼，并受到世界动物保护协会和⼈员的强烈反对，⽬前主要⽤于医药⽅⾯。

因此，动植物源蛋⽩酶不能满⾜当代⼯业的需要。

微⽣物源蛋⽩酶⼏乎具有所有植物和动物来源蛋⽩酶的应⽤特性，成为了⽬前的蛋⽩酶的重要来源。

据统计，微⽣物蛋⽩酶占据了世界蛋⽩酶销售⼤约70%以上的份额。

⽬前商业化的蛋⽩酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋⽩酶来⾃植物⽊⽠，⽽来源于真菌的极少。

⽬前，国内外学者对来源于霉菌的蛋⽩酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提⾼蛋⽩酶的产量或通过分离纯化其产⽣的部分酶进⾏性质研究；⽽优化发酵条件很难⼤幅度提⾼蛋⽩酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株⽣长状态)影响。

微生物学实验技术(研究生)

食品微生物实验技术讲义（硕士研究生用）食品科学与工程学院微生物学实验技术的体系具有独特性：需要独特的实验室装备和独立的训练技术包括：显微镜术和制片染色技术、无菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。

第一章微生物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。

细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。

大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。

在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。

由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。

显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。

实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。

第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。

因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。

微生物的基本培养技术讲义高二下学期生物人教版选择性必修3

一微生物的基本培养技术【知识链接】一、培养基的配制1.培养基的概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基,用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。

2.培养基的种类:3.营养组成:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。

4.培养基特殊需求:(1)培养乳酸杆菌时,在培养基中添加维生素。

(2)培养霉菌时,将培养基调至酸性。

(3)培养细菌时,将培养基调至中性或弱碱性。

(4)培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。

二、无菌技术1.目的:防止实验室的培养物被杂菌污染(获得纯净培养物);有效避免操作者自身被微生物感染。

2.关键:防止杂菌污染。

3.常见方法:(1)概念:①消毒:使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的一部分微生物(不包括芽孢和孢子)。

②灭菌:使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。

(2)类型与方法:连一连:将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。

三、微生物的纯培养1.微生物纯培养的概念:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,获得纯培养物的过程就是纯培养。

2.酵母菌的纯培养:3.基于对酵母菌接种过程的理解,下列接种过程正确的顺序是baefcgd。

知识点一培养基的配制1.培养基的种类、特点及作用的分析:【特别提醒】常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选利用大气中N2的微生物。

②含青霉素的培养基可淘汰细菌,筛选出真菌。

③无有机碳源的培养基可筛选出自养生物。

2.培养基的成分、功能及来源分析:【特别提醒】有关培养基营养物质的三点提醒(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。

①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。

②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。

(2)微生物需要补充生长因子,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。

(3)微生物需要量最大的是碳源,能合成含碳有机物的是自养型,反之则为异养型。

(完整版)微生物学实验指导书

03微生物在自然界和人类生活中的作用阐述微生物在生态系统、工业生产、医疗卫生等领域的重要性。

01微生物的定义与分类包括细菌、真菌、病毒等微生物的基本概念和分类方法。

02微生物的生物学特性介绍微生物的形态、结构、生理生化特性等。

微生物学概述01实验室安全制度包括实验室安全守则、危险标识识别、紧急情况下的应对措施等。

02实验操作规范介绍实验前准备、实验过程中的操作规范、实验后清理等注意事项。

03生物安全阐述生物安全的概念、生物安全级别的划分及相应防护措施。

实验室安全与规范介绍显微镜的种类、使用方法和维护保养。

显微镜介绍离心机的类型、使用方法和维护保养。

离心机阐述培养箱和摇床的工作原理、使用方法和注意事项。

培养箱与摇床包括分光光度计、电泳仪、PCR 仪等设备的简要介绍和使用方法。

其他常用设备常用仪器与设备实验报告格式包括标题、作者、摘要、正文、结论、参考文献等部分的撰写要求。

数据处理与图表制作介绍数据处理的方法、图表的制作规范及注意事项。

实验结果分析与讨论阐述实验结果的分析方法、讨论实验结果的合理性及可能存在的问题。

实验报告提交与评审说明实验报告的提交方式、评审标准及相关注意事项。

实验报告撰写要求03根据实验需求，选择适当的培养基类型，如营养琼脂、马丁氏琼脂等。

选择合适的培养基按照培养基配方准确称量各成分，加入蒸馏水或去离子水，加热溶解后调整pH 值。

配制培养基将配制好的培养基分装到试管、培养皿等容器中，采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法进行灭菌处理。

培养基分装与灭菌培养基制备与灭菌微生物接种与培养接种前准备准备好无菌操作台、无菌接种环、酒精灯等接种工具，确保无菌操作环境。

微生物接种采用划线法、倾注法等方法将待测微生物接种到培养基上。

培养条件设置根据微生物的生长需求，设置好培养温度、湿度和光照等条件。

观察前准备准备好显微镜、载玻片、盖玻片等观察工具，确保无菌操作环境。

微生物形态观察通过显微镜观察微生物的形态、大小、排列方式等特征，记录并描述观察结果。

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实验一革兰氏染色实验一、目的要求1、学习并初步掌握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、器材1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

2、其他：革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。

四、操作步骤1. 涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。

固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2. 染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。

（5）镜检干燥后，置油镜观察。

革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。

此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，常呈阴性反应。

五、实验报告1．结果：在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？2．思考题(1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？(2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?(3)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢？（4）革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（5）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？（6）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别是什么颜色？（7）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验二酵母细胞数量及出芽率的测定-－血球计数板法一、目的要求1．了解血球计数板的构造和使用方法。

2．学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

3．学会出芽率的测定。

二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的（0．1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则三、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，玻璃棒。

四、操作步骤1．稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

注意不可有气泡产生。

4．显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。

每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

出芽的酵母，芽体大小达到酵母细胞的一半时，即作两个菌体计数，芽体小于菌体1／2时为细胞芽体，计数细胞芽体的数目，计算出芽率。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

5．清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验报告1．结果将结果记录于下表中。

A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

2．思考题根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？实验三土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定1 培养基的配制及灭菌【目的要求】1．了解培养基的概念、种类及用途2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序3．学习和掌握细菌、放线菌、霉菌常用培养基的配制方法。

【基本原理】培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。

自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。

不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。

此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。

高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。

马丁氏培养基用于霉菌的分离培养。

【材料与用品】1．材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO4•7H2O、NaOH溶液（1mol/L）。

【仪器与用品】天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。

一、肉膏蛋白胨培养基的配制1．培养基成分牛肉膏0. 3g蛋白胨1gNaCl 0.5g琼脂 1.5g水100mLpH 7.2~7.42．配制方法（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。

然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。

（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。

（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。

（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。

（5）分装、加塞、包扎。

（6）高压蒸汽灭菌20分钟。

待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。

二、高氏一号培养基的配制1．培养基成分可溶性淀粉20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂20g水1000mLpH 7.2～7.42．配制方法（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。

再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。