制药工程专业微生物实验讲义
制药工程基础实验实验
实验一、培养基的配置与微生物的接种培养实验（一）实验目的：通过实验，使学生了解和掌握培养基的配置、消毒方法和接种与培养技术。
了解微生物对营养物质的需求，不同微生物的生长差异。
（二）实验原理：微生物必须在含有所需要的营养元素的培养基上才能生长，不同种类的微生物有它所适宜生长的培养基，细菌和真菌的培养基不同，在长期的实践中形成了有些著名的培养基配方和配置方法。
微生物的培养过程中要防止其他微生物的存在和生长，因此在接种和培养过程中要进行灭菌和消毒，防止杂菌的干扰。
灭菌方式中广泛使用的是蒸汽灭菌，即湿热灭菌。
是热灭菌的好处是灭菌效果好，因蛋白质在含水时易变性，另外蒸汽穿透力大，含能量高。
使用蒸汽灭菌器要注意排气完全，否则达不到灭菌温度。
表1表示排空气程度与实际温度的关系。
蒸汽灭菌器的压力有的以1b/in（磅/英寸）、kg/cm表示，现统一以帕（Pa）或千帕（kPa）表示，它们与温度的关系如表4-2。
表2 蒸汽压力与温度的关系*指活菌数减少一个对数级即90%被杀死所需的时间。
蒸汽灭菌适用范围很广，但主要是培养基的灭菌。
在培养基灭菌中最需注意不要过多破坏营养，特别是糖类。
糖类在湿热灭菌时破坏情况见表3。
（三）实验材料1.大肠杆菌、红豆杉内生真菌。
2.生化培养箱。
3.超静工作台3.接种环或无菌牙签。
4.酒精灯。
5.无菌培养皿。
6.肉汤培养基牛肉膏0.5g 水100ml蛋白胨 1.0g PH 7.2NaCl 0.5g加入1.2％琼脂，即为固体完全培养基（CM）。
7.PDA培养基：PDA）：马铃薯煮汁100毫升蔗糖2克琼脂 1.5克PH值 5.5～6.0制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称20克，加水100毫升，煮沸20分钟后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁。
然后加琼脂和蔗糖煮溶，后补足水分至100毫升，装培养皿灭菌备用。
（四）操作步骤1按上述要求配置2种培养基，分别装入培养皿；2放入高压锅中蒸汽灭菌20min。
《药学微生物》3-2-1 制药过程中的微生物控制
软化水是指除去了部分或全部 钙、镁离子的水。
软化水通常用来清洗装液体或 半固体制品的容器和冷却系统装置。
（2）去离子水和蒸馏水
自来水经过阴离子和阳离子交换树脂去 除离子后制成的水为去离子水。
蒸馏水是指用蒸馏
洗瓶
方法制备的纯水。
配药、容器和设备的清洗和消毒溶液的 配制都需使用去离子水。
药物的生产需要使用蒸馏水，但需要微生物 含量较低，其制备过程中通常还需对蒸馏水进 行热消毒的处理。通过蒸馏器得到的蒸馏水中 通常不会残留微生物，只有当冷却系统、储水 容器或分装系统出现问题时才会发生污染，蒸 馏水一般是在制得后才被污染的
空气中分离的微生物包括：
产芽孢的细菌：如杆菌属和梭菌属菌种；不产 芽孢的细菌：如葡萄球菌属、链球菌
属和棒状杆菌属的菌种； 霉菌：有青霉属、分支孢子霉菌属、曲霉
属以及毛霉属的菌种； 酵母菌：有红酵母菌属的菌种等。
空气中微生物的数量依赖于微生物在 环境中的生存能力和灰尘的分布量。 通风、排气系统、热源上的对流和空 间内的活动都能影响气流，使灰尘分 布发生变化，影响微生物的沉降。
一般情况下洁净生产区域内所有的窗 户只能用来采光，不能打开通风，只通过 空气净化系统进行空气置换。
（七）设备 1、设备、管道微生物
制药机械设备及管道等不经常清洗 消毒，微生物会滞留和滋生。
生产设备及管道最常用的材 料是不锈钢、玻璃和塑料。 管道系统的设计中，经常会 将连接部分置于一个能让清 洁剂和消毒剂方便清洗和消 毒的位置。
2、清洁、消毒与灭菌等微生物的减少
储藏容器和反应容器可以用自动旋转压 力喷雾器清洁和消毒，喷雾器要放在容器 中能够处理最大面积的位置。 搅拌器、管道的出入口和通风口都要手 工清洁。 清洁剂有酸性、碱性、阴离子、阳离子 和非离子等多种，但所选用的清洁剂必须 适于表面清洁但不产生腐蚀作用，应易于 清除产品、无残留、可溶于水。 有时需要将清洁剂和消毒剂混合使用， 这时两种剂型互溶效果才更好。
制药工程 实验讲义
制药工程专业实验讲义目录实验室安全技术知识简介………………………………………………实验一苯佐卡因(Benzocaine)的合成……………………………实验二黄柏中盐酸小檗碱的提取及薄板层析…………………实验三乙酰水杨酸合成(设计性实验) …………………………实验四相转移催化法合成dl-扁桃酸实验室安全技术知识简介一、化学试剂的一般安全知识许多化学试剂具有易燃、易爆和易使人中毒的性质，通常称其为化学危险品。
目前，约有2 000种左右的化学试剂被列为危险品。
运输和公安部门根据发生危险事故的情况，将它们分成8类，每类的危险特性各异。
现分别简述如下：1．爆炸性试剂爆炸品是指受外界的引发，在产生剧烈化学反应同时，放出大量的热能和气体(CO2、CO、H20、N2等)的物质。
按“危险品安全管理规则”(以下简称“危规”)规定，爆炸品可分为4类：(1) 点火器材(如导火绳等)；(2) 起爆器材(如雷管等)；(3) 炸药及爆炸性药品(如苦味酸、三硝基甲苯等）；(4) 其它爆炸品(如焰火、爆竹等)。
2．液化气体和压缩气体临界温度在常温以上的气体受压液化后装在耐压容器内，称为液化气体(如浓氯、液氨等)；临界温度在常温以下的气体，在常温压入耐压容器，称为压缩气体。
这两类气体的膨胀力随温度升高而增大，因此，要置阴凉通风处，防止日光直晒。
按“危规”规定，气体试剂可分为剧毒、易燃、助燃和不燃气体4类。
3．易燃液体试剂这类试剂在正常工作环境温度下产生的蒸气遇火源就燃烧。
由于有流动性和较高的蒸气压，使危险的范围和着火爆炸的危险程度增大。
温度越高，液体的蒸气压越大，其燃烧的危险性也就越大。
通常以闪点来衡量易燃液体的危险程度相划分等级。
闪点(闪光点)即可燃液体的蒸气与靠近被面的空气温合到一定比例后闪燃的最低温度。
一般来说，闪点越低，越易燃烧。
由于正常生产过程中的环境温度和自然气温有所不同，按闪点来划分易燃液体的等级也就有所不同。
有的规定，闪点低于28℃者为一级易燃品，闪点在28～45℃者为二级易燃品，也有的规定，闪点低于-18℃者、-18～23℃者和23～61℃者分别称为低闪点、中闪点和高闪点易燃液体。
制药工程专业微生物实验讲义
（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
制药工程专业微生物实验讲义
实验1: 显微镜的使用及细菌形态的观察（2学时）目的要求(1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。
(2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
1.基本原理显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。
油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。
油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。
根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。
油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。
使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。
这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。
当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。
如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。
所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA＝n·sinα式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。
因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。
同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。
如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则：以空气为介质时：NA=1×0．87=0．87以水为介质时：NA=1．33×0．87=1．15以香柏油为介质时：NA=1．52×0．87=1．32显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。
最新微生物制药课件PPT课件
1，4和1，6 糖苷键
从非还原性 末端开始
水解产物
葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖 异麦芽糖、低聚糖
葡萄糖
1、液化原理
由于淀粉颗粒的结晶
1）淀粉的糊化与老化 性结构对酶作用的抵抗力
非常强,不能使淀粉酶直接
作用于淀粉,而需要先加热
淀粉乳,使淀粉颗粒吸水膨
胀、糊化，破坏其结晶性
淀粉糊化
的结构。
是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，
淀粉11蓝Fra bibliotek精红糊精
无色糊精 麦芽糖
（C6H10O5)n+nH2O
酸或酶 n C6H12O6
葡萄糖
葡萄糖值---DE值
工业上用DE值（也称G值）表示淀粉糖的糖组成。糖
化液中的还原糖含量（以G计算）占干物质的百分率称为。
还原糖含量
DE值 =
100%
干物质含量
一、淀粉水解糖的制备方法
用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、 大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采 用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、 酶解法以及酸酶结合法等三种。
有机物质相结合，产生色素。
实验结果证明： 1）5`-羟甲基糠醛是产生色素的根源； 2）色素的生成量随葡萄糖浓度的增加而增加； 3）PH值等于3时，色素的生成量最小。
22
2、酸水解工艺
1）酸法糖化工艺流 程
淀粉
盐酸
水
调浆
Na2CO3 中和脱色
蒸汽
糖化
压滤
活性炭
冷却
23
滤渣 糖液
淀粉的酸水解工 艺是根据淀粉在水解 过程中的水解反应和 复合反应规律性来决 定的。在制定工艺条 件时既要保证淀粉的 彻底水解，达到较高 葡萄糖量，又要尽可 能减少葡萄糖复合、 分解反应的发生程度， 此外，还要符合目的 产物的发酵条件，符 合发酵工艺的实际情 况。
生物制药专业综合实验讲义
生物技术制药实验课程实习讲义人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的表达与纯化生物与制药工程学院制2016年6月2日目录第一节引言................................ 错误！未定义书签。
1.1表皮生长因子(EGF)概述 (2)1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (3)1.3 EGF的生物学效应及应用 (4)1.4 本实验课程设计的目的与内容 (5)第二节 EGF基因的合成与转化表达 (6)1.实验原理 (6)2.实验材料与方法 (7)2.1 实验材料及仪器 (7)2.1.1 试剂材料及试剂 (7)2.1.2 仪器设备 (8)2.2 实验方法 (8)2.2.1 试剂及培养基配制方法 (8)2.2.2目的基因hEGF的设计与合成 (9)2.2.4 电泳检测质粒DNA (10)2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备 (11)2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3） (12)2.2.7检测转化是否成功 (12)2.2.8双酶切并检测 (12)2.2.9 EGF基因的PCR扩增验证 (13)2.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测 (14)第三节 EGF表达蛋白的纯化与检测.............. 错误！未定义书签。
3.1 实验原理 (19)3.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法 (20)3.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性 (21)第一节引言1.1表皮生长因子(EGF)概述生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。
生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。
所研究的表皮生长因子( Epidemal growth factor，EGF)，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。
在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。
制药工程原理实验讲义
学生实验守则1、遵守纪律不迟到不早退，在实验室内保持安静，不大声谈笑，遵守实验室的一切规章制度，听从教师指导。
2、实验前要认真预习，作好预习报告，经教师提问通过后，方可准予参加实验。
3、实验时要严格遵守仪器、设备、电路的操作规程，不得擅自变更，操作前须经教师检查同意后方可接通电路和开车，操作中仔细观察，如实记录实验现象和数据。
仪器设备发生故障严禁擅自处理，应立即报告教师。
4、实验后根据原始实验数据记录，处理数据、分析问题及时作好实验报告。
5、爱护仪器、注意安全、水，电，煤气，药品要节约使用。
6、保持实验室整洁，废品，废物丢入垃圾箱内。
7、实验完毕记录数据须经教师审查签字，做好实验室的清洁工作，恢复仪器设备原状，关好门窗，和检查水，电，气源是否关好，方可离开实验室。
实验一 柏努利实验一、实验目的1、通过实测静止和流动的流体中各项压头及其相互转换，验证流体静力学原理和柏努利方程。
2、通过实测流速的变化和与之相应的压头损失的变化，确定两者之间的关系。
二、基本原理流动的流体具有三种机械能：位能、动能和静压能，这三种能量可以互相转换。
在没有摩擦损失且不输入外功的情况下，流体在稳定流动中流过各截面上的机械能总和是相等的。
在有摩擦而没有外功输入时，任意两截面间机械能的差即为摩擦损失。
流体静压能可用测压管中液柱的高度来表示，取流动系统中的任意两测试点，列柏努利方程式：∑+++=++f h p u g Z P u g Z ρρ2222121122对于水平管，Z 1=Z 2，则 ∑++=+fh p u p u ρρ22212122若u 1=u 2, 则P 2<P 1；在不考虑阻力损失的情况下，即Σh f =0时，若u 1=u 2, 则P 2=P 1。
若u 1>u 2 , p 1<p 2；在静止状态下，即u 1= u 2= 0时，p 1=p 2。
三、实验装置及仪器图2－2 伯努利实验装置图装置由一个液面高度保持不变的水箱，与管径不均匀的玻璃实验管连接，实验管路上取有不同的测压点由玻璃管连接。
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（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2. 加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3. 调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸检测，直至达到所需pH范围。
若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。
pH的调节通常放在加琼脂之前。
应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4. 过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
但是供一般使用的培养基，此步可省略。
5. 分装：披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。
分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。
半固体培养基以试管高度的1/4为宜．灭菌后垂直待凝。
6. 加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法则图1－1。
棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。
要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。
有些微生物需要更好的透气，则可用8层纱布制成通气塞。
有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。
7. 包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸。
然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8. 灭菌：将上述培养基于121．3℃湿热灭菌20min 。
如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。
9. 摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。
10. 无菌检查。
将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h ，无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。
图1-1 棉塞的制作过程(二)高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。
其配方如下：可溶性淀粉20g ，KNO 31g ，NaCl 0.5g ，K 2HPO 4·3H 2O 0.5g ，MgS04·7H 2O 0.5g ，FeSO 4·7H 2O 0.01g ，琼脂15—20g, 水1000mI ，pH 7.2-7.4。
1. 称量和溶解：经计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放人小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。
对微量成分FeSO 4.7H 2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL 水中加入1g 的FeSO 4.7H 2O ，配成浓度为0.01g ／mL 的贮备液，再在1000ml培养基中加入以上贮备液1mL即可。
待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白脏培养基配制。
2. pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查，与牛肉膏蛋白胨培养基配制方法同。
(三)马铃薯蔗糖培养基的配制马铃薯培养基是用于分离真菌的选择培养基。
其配方如下：马铃薯200g，葡萄糖（或蔗糖）10g，琼脂15-20g，水1000mI，自然pH。
1. 称量和溶解。
马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤，滤液加糖，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制，补足水至所需的总体积。
2. 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。
3. 链霉素的加入。
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降全45℃左右时才能加入。
可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在1000mL 培养基中加1％链霉素0.3mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。
注意事项:称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖：调pH时要小心操作，避免回调。
(四)高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。
1. 加水。
将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为宜。
2. 装料。
将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。
装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以免冷凝水沾湿棉塞。
3. 加压。
将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀。
4. 排气。
用电炉或煤气加热，待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出. 一般排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净(沸后约5min)。
5. 升压。
当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。
本实验用121℃，20min灭菌。
7. 降压。
达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀，放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。
8. 无菌检查将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。
五、问题和思考1. 配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查？3. 试设计实验对饮料进行无菌检查。
实验二从土壤中分离和纯化微生物一、实验目的1．学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术；2．掌握微生物样品稀释法和涂布平板法分离微生物的操作技术；3．初步掌握无菌操作技术和平板菌落计数法。
二、实验原理1. 什么是微生物的纯培养,从固体培养基中分离微生物的方法有哪些?2. 为什么可以根据菌落数目来计算样品中微生物的数量?三、实验材料和用具土壤样品：有目的地取某一类型的土壤。
培养基：已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基，90mL无菌水(带玻璃珠)1瓶、100无菌水、无菌试管、10％酚液、1%链霉素。
无菌培养皿12套、5mL和1mL的无菌移液、天平、称量纸、药勺、试管架、涂布器。
四、操作步骤(一)土壤稀释分离1. 取土壤。
取表层以下5—10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2. 制备稀释液(1) 制备土壤悬液：称土样10g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(90mL)，振荡20min使土样充分打散，即成为10-1的土壤悬液。
(2) 稀释：用无菌移液管吸10-1的土壤悬液0.5mL．放入4.5mL无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-3一10-8的稀释液(图2-1)。
注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。
图2-1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解3．稀释倒平板法测定菌落数的方法(1) 将培养基加热熔化，冷至55－60℃，在高氏1号培养基中加入10%酚数滴，在马铃薯培养基中加入链霉素溶液至终浓度为30ug/mL，混匀后倒入平板。
倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。
图2-1 倒平板的方法(2)取土壤稀释液高氏一号培养平板：取10-3、10-4两管稀释液各0.1mL分别接人相应标号的含该种培养表面的中央；PDA培养平板：取10-3、10-4两管稀释液各0.1mL，分别接人相应标号的平皿中；牛肉膏蛋白胨培养平板：取10-6、10-7、10-8三管稀释液各0.1mL，分别接人相应标号的平皿中；(3)涂布：玻璃涂棒灭菌后，十字涂布（演示），静置5-10min。
4．培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，细菌于237℃恒温培养，培养1—2d；放线菌和霉菌28℃培养，分别培养5—7d或3—5d，可用于观察菌落，用于进一步分离纯化或直接转接斜面。
五、注意事项1. 一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之．而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤个分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落达成一片不能计数。
2. 在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
3. 放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
六、实验报告1. 记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。
计算方法：选择长出菌落数30一300之间的培养皿进行计数, 按以下公式：总菌数／g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数七、问题和思考1．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌．并进行计数。