微生物实验(4)
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察（一）放线菌的形态观察1 目的观察放线菌的基本形态特征掌握培养放线菌的几种方法2 原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。
放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。
孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。
它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。
放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。
3 材料3.1 菌种灰色链霉菌(Str. griseus),天蓝色链霉菌(Str. coelicolor),细黄链霉菌（Str.microflavus）。
3.2 培养基高氏1号培养基。
3.3 器皿培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)、水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。
4 流程4.1插片法: 倒平板→插片→接种→培养→镜检→记录绘图4.2压印法: 倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图4.3埋片法: 倒琼脂→切槽→接种→培养→镜检→记录绘图5 步骤5.1插片法5.1.1倒平板将高氏1号培养基熔化后，倒10~12毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用.5.1.2插片将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3(图5-1)。
5.1.3接种与培养用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培养3～7天。
5.1.4观察培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。
直接在显微镜下观察。
5.2压印法5.2.1制备放线菌平板同5.1.1。
在凝固的高氏1号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线菌菌落。
实验4微生物菌落的观察
实验4微生物菌落的观察
一、实验前的准备
（1）准备Petri瓶：Petri瓶是用于生物实验的一种透明塑料或玻
璃容器，可以在其上进行微生物菌落的观察。
Petri瓶的直径大约为9厘米，高度约为2厘米，它一般具有一个小孔，可以用于把培养基引入或培
养基排出。
（2）准备培养基：培养基是用于培养微生物菌落的一种特殊的液体，它通常由淀粉、糖、氮源等组成，可以提供微生物需要的必要营养和营养素。
（3）准备所需的用具：为了完成本次实验，还需要准备一些实验室
常用的用具，如烧杯、移液器、滴管、温控器等。
二、实验过程
（1）将培养基倒入Petri瓶中：将恰当量的培养基倒入清洁的
Petri瓶中，使外壁和底部充分接触培养基，确保培养基在容器内均匀分布。
（2）加入微生物样品：将微生物样品放入容器中，用移液器将样品
匀化，然后用滴管将样品分散在培养基表面，确保培养基表面有足够的微
生物样品。
（3）培养：用温控器控制温度，一般情况下，需要将温度调节在
25℃~30℃之间，并维持适当的湿度，使微生物菌落能够正常生长，一般
情况下，可以在24~36小时内获得较好的观察结果。
（4）观察：取出Petri瓶。
微生物大小的测定-实验四
实验四 微生物大小的测定一、实验目的1. 熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法, 掌握测定微生物大小的技能。
3. 巩固光学显微镜的使用方法二、实验要求1. 预习有关微生物大小测定等方面的知识；2. 遵守实验室安全制度, 听从指导教师安排； 3．认真听讲, 不懂就问；4. 完成实验报告三、实验仪器和材料目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片四、实验原理及方法1.目测微尺:目镜测微尺是一块圆形玻片, 在玻片中央把5mm 长度刻成50等分, 或把10 mm 长度刻成100等分。
测量时, 将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同, 目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样, 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正, 以求出在一定放大倍数下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2.物测微尺中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般将1mm 等分成100格, 每格长0.01mm （即10µm ）。
它并不直接测细胞的大小, 而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
五、实验步骤及内容1. 目测微尺的标定两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。
用低倍镜找到物测微尺的刻度, 移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合, 顺着刻度找出另一条重合线。
再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。
2. 菌体大小的测量将物测微尺取下, 换上标本片, 选择适当的物镜测量目的物的大小, 分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数, 再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。
六、实验结果1.将目镜测微尺校正结果填入表1物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度2.在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大., 将结果填入表2序号长/um 宽/um 菌体大小（平均值）长/um×宽/um目镜测微尺格数菌体长度目镜测微尺格数菌体宽度1 2 3 4 5七、思考题1.不改变目镜和目镜测微尺, 而改用不同倍数的物镜来测定同一细菌的大小, 目镜测微尺上所量的物镜上物体的实际长度是否相同？为什么？相似。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
四、菌种衰退的原因
▪ 基因突变－－主要原因 ▪ 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 ▪ 2、表型延迟造成菌种衰退 ▪ 3、质粒脱落导致菌种衰退 ▪ 连续传代－－加速衰退 ▪ 不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退
五、菌种衰退的防止
▪ 控制传代次数 ▪ 创造良好的培养条件 ▪ 利用不易衰退的细胞移种传代 ▪ 采用有效的菌种保藏方法 ▪ 讲究菌种选育技术 ▪ 定期进行分离纯化，测试性能
干燥或较干燥 小而紧密
丝状交织，紧密 细而均匀
干燥 大而疏松或大而致密
丝状交织 粗而分化
菌落透明度
菌落与培养 基结合程度
菌落颜色 参 考 菌落正反面 特 颜色的差别 征
菌落边缘
细胞生长速度
气味
透明或稍透明 不结合 多样 相同
一般看不到细胞 一般很快
一般有臭味
稍透明
不透明
不结合
牢固结合
单调，一般呈乳脂或矿 烛色，少数红色或黑色
实验四 微生物的菌落形态观察、 平板菌落计数及菌种保藏
目的要求
1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态 特征，并加以区分。
2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，
并接种于斜面，进一步加强无菌操作技 术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见 方法。
实验内容
▪ 微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、 霉菌、酵母菌——放在后面介绍）
做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 （4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产
品。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
接种针往外移
动同时自动将 样品稀释1000 倍。
国外微生物学基础实验(四 )-英文版
Mycobacterium Pink colonies tuberculosis Endospore stain E. coli Enterobacter aerogenes Forms endospores Bacillus subtilus
Bacteria Detective
In order to figure out what organism your unknown is, you will need to… 1. Examine your Gram and Acid fast and Endospore stain results.
Apply crystal violet for 1 minute, wash, blot dry.
Blotting paper : Ziehls carbolfuchsin (3 – 5 min heat) : rinse: Acid Alcohol (10 – 15 sec) : rinse : crystal violet (1 min)
Mordant is a chemical used to fix the staining reaction
The structure of the thinner cell walls of Gram negative bacteria cannot hold the dyes previously used, once the decolorizer is applied.
Endospores cannot be stained by normal staining procedures because their walls are practically impermeable to all chemicals.
(完整版)实验四细菌抹片的制备及染色
实验四细菌抹片的制备及染色实验班级：2017级牧医高职（动物微生物）指导老师：陶波实训地点：实训室207时间：2018年6月【目的要求】1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。
2.认识革兰氏染色和瑞特氏染色的反应特性。
【实验材料】试剂用品：载玻片、接种棒、酒精灯、吸水纸、生理盐水、染色液等。
菌种：羊、兔粪便便中提取培养的细菌。
【实验内容】一、细菌涂片的制备1.载玻片准备载玻片应清晰透明，如有残余油渍，可用95%酒精清洗。
2.抹片根据材料情况不同，抹片方法也有差异。
液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片中央均匀涂布适当大小或可采用推片法。
非液体材料（菌落、脓、粪便）应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。
组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上触片或涂抹成薄层。
3.干燥上述涂片应让其自然干燥或适当烘干处理。
4.固定有两类固定方法火焰固定法：将干燥好的抹片使其涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰来回拖过数次，略作加热进行固定。
化学固定法：血液、组织脏器等抹片要做姬姆萨染色，不同火焰固定，可将干燥后的抹片滴加数滴甲醇其实作用2~3min后自然干燥进行固定（瑞士染色可不做甲醇固定）。
二、几种常用的染色方法（一）姬姆萨染色将足量的姬姆萨溶液（或将姬姆萨原液稀释）滴加到抹片上，或将抹片浸入盛有姬姆萨染液的染缸中浸染30min 至数小时，取出后水洗，吸干水分后镜检。
（二）瑞特氏染色瑞氏染料是碱性美蓝与酸性伊红混合而成的染料，当溶于甲醇后立即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。
由于细菌菌体蛋白偏酸性，菌体带负电（菌体蛋白等电点多在pH2~5），被染成蓝色。
在以固定好的涂片或触片上滴加足量的瑞氏染液，染色3~5min后水洗，吸干水分后镜检（如染色不理想可重复几次）。
实验四、环境中微生物的检测课件
观察
补做实验一 下周实验课暂停一次
第一部分：环境中微生物的检测
一、背景介绍 什么是微生物 微生物分布
二、实验目的 了解环境中微生物的分布情况
三、实验原理 提供微生物生长所需的营养要素，在实验
室中培养微生物 灭菌的方法和原理 培养基的特性
四、实验方法 1、倒平板
2、环境中微生物的检测
五、实验报告
记录你所培养的微生物的形态
观察时间4月5日（下周四）
12：00——13：00
梅老师班：外间202
尹老师班：里间203
三、个体形态的观察 1、细菌：简单染色法（接种环，取样）
Hale Waihona Puke 、酵母：水封片3、放线菌：插片法
4、霉菌：切片
作业：
1、将观察的细菌、酵母菌、放线菌、霉 菌其菌落特征填入表格
2、划出细菌、放线菌的个体形态简图
3、初步判断你所培养的环境中的微生物 属于哪一大类并说明理由
预习：实验七 生物体内部组织细胞的切片观察（一）
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
天牡
开丹
放花
；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天 是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
微生物实验四细菌的涂片及简单染色法和革兰氏染色法经典法
【实验报告】
• 2）填表
•
表1 细菌形态的描述
【实验报告】
•
2．思考题
•
（1）涂片为什么要固定，固定时应注
意什么问题？
•
（2）你在涂片染色过程中遇到了什么
问题？试分析其中原因？
•
ห้องสมุดไป่ตู้
（3）革兰氏染色中哪一步是关键，为
什么？你如何控制这一步。
•
（4）不经复染这一步，能否区别革兰
氏阳性菌和阴性菌？
• 2、仪器 显微镜(25台)； • 3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个）
，接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油 ，吸水纸，染色缸等；
【实验用品】
• 4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet , CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。
1）草酸铵结晶紫染液的配制：
A液： 结晶紫
•
染色前必须先固定细菌，其目的有二
：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘
附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力
。常用的有加热和化学固定两种方法。固
定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞
膨胀或收缩。
【基本原理】
• 二、革兰氏染色法（经典法）基本原理 • 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重
要性状 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观
【方法步骤】
• 3、染色
•
⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结
晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。
倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
•
⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
•
⑶脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立
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基因型和表型变异的比较
基因型变异 基因结构 可逆性 稳定性 变化 不或极少 稳定 表型变异 未变 可逆 不稳定
环境影响
涉及细菌数
不受影响 个别
受影响 全体
பைடு நூலகம் 基因型？表型？
结核杆菌可发生菌落、毒力、耐药性变异。 牛型结核杆菌(有毒株H37Rv)
• 耐药程度用某药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)表示。
H-O变异
原理：将有鞭毛的普通变形杆菌点种在琼 脂平板上，由于鞭毛的动力使细菌在平板 上弥散生长，菌落形似薄膜(H菌落)；若将 此菌点种在含0.1%石炭酸的培养基上，细 菌失去鞭毛，只能在点种处形成不向外扩 展的单个菌落(O菌落)。此变异是可逆的。
公共邮箱：microbiology_lab@ 密码：123456
实验四、 细菌变异现象观察及其毒力测定
河南大学医学院 娄强
qiang_lou@
目的要求
• 掌握内毒素测定的实验原理及实验方法。
• 理解细菌变异的原因，观察细菌变异现象， 加深对变异机制的认识。
细菌的变异现象
H-O变异
• • 菌种：变形杆菌 培养基：普通琼脂平板及0.1%石炭酸琼 脂平板
实验方法：
•
1. 本别在普通琼脂平板和0.1%石炭酸琼脂平板的 边缘四端点种变形杆菌； 2. 置37oC培养24h，观察菌落有无迁徙现象。
细菌的致病性
• 荚膜、内毒素、外毒素、酶
• 内毒素的检测-鲎试验 原理：鲎是海洋中的一种冷血节肢动物，其血液 中有一种特殊的变形细胞，内含凝固酶原和可凝 固蛋白。将此变形细胞冻融后制成鲎变形细胞溶 解物（即鲎试剂）。内毒素能激活其中的凝固酶 原使之变成凝固酶而使可凝固蛋白凝结成凝胶状 态。用以检查药液或注射液是否有内毒素污染。 能测出0.01~1.0ng/ml的内毒素。
胆汁-甘油-马铃薯培养 13年，230次传代
BCG(减毒株H37Ra)
耐药性分类
• 细菌耐药性（drug resistance）亦称抗药性，是指细菌 对某抗菌药物（抗生素或消毒剂）的相对抵抗性。指病原 体或肿瘤细胞对反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消 失的现象。
• 天然或突变产生的耐药，即染色体遗传基因介导的耐药。 • 质粒介导的耐药性，即细菌因获得了由质粒、噬菌体或其 他外来DNA片段，所致的细菌耐药，其所带的耐药基因 易于传播，在临床上占有重要地位。
• 结果记录： +++ 固体 ++ 凝胶 + 粘液 未凝固
耐药机制
• 针对不同的药物有不同的耐药机制。
– 接合：细胞间通过性菌毛相互沟通，将遗传物质如质粒或染色质 DNA从供体菌转移给受体菌。 – 转导：以噬菌体及其含有的质粒DNA为媒介，介导供体菌耐药基 因转移给受体菌内。 – 转化：少数细菌可从周围环境中摄入裸DNA，并掺入到细菌染色 体中。 – 针对β内酰胺类抗生素：产生β内酰胺酶；青霉素结合蛋白（PBP） 的作用位点改变或产生新的对β内酰胺类抗生素不敏感的PBP； 革兰阴性细菌外膜通透性降低和主动外排系统将抗生素泵出胞外。
鲎试验
• 材料：大肠杆菌裂解物、鲎试剂、标准内毒素、蒸馏水、 小试管、吸管、37℃水浴箱
• 实验方法： 1. 打开3支鲎试剂，每支各加入0.1ml蒸馏水溶解，并编号； 2. 将3支鲎试剂分别加入标准内毒素、蒸馏水、大肠杆菌裂解物各0.1ml， 摇匀。 3. 置37oC水浴箱，15~30min取出。