支原体培养基灵敏度检査(变色单位试验法)
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法主要有以下几种：
1. PCR法：即聚合酶链反应，在医学领域中被广泛应用于病原体的检测。
PCR法可以通过扩增病原体DNA的特定片段来检测支原体的存在与否。
该方法具有高灵敏度和高特异性。
2. 培养法：支原体可以在特定培养基中进行培养和繁殖。
通过将样品涂布到培养基上，培养一定时间后观察培养基上是否有支原体的生长，从而判断有无感染。
3. 免疫学检测法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法等。
这些方法通过检测患者血清中的特定抗体或抗原来判断是否感染支原体。
4. 基因测序法：通过对支原体基因组进行测序，可以准确确定其种类和亚型，进而进行分子流行病学研究和溯源分析。
5. 免疫组化方法：利用特定抗体对支原体进行染色，通过显微镜观察标记物的分布和形态特征来检测支原体的存在。
以上是常用的支原体检测方法，每种方法都有其适用的场景和优缺点。
支原体培养基灵敏度检査(变色单位试验法)
支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）及供试品检查方案目的：建立支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）及供试品检查方案。
范围：适用于支原体培养基灵敏度检査及供试品检查。
依据：《中国药典》2015年版内容:1、概要：除药典推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。
2、设备生化培养箱、生物安全柜。
3、培养基灵敏度检査（变色单位试验法）3.1干粉培养基及对应菌种产品号产品名称菌种名称菌种编号11109 支原体肉汤培养基肺炎支原体ATCC 15531株11C21 精氨酸支原体肉汤培养基口腔支原体ATCC 23714株11A09 支原体半流体培养基肺炎支原体ATCC 15531株11321 精氨酸支原体半流体培养基口腔支原体ATCC 23714株3.2 培养基配制按照标签处方量配制成液体培养基，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌，待用。
3.3灵敏度检查3.3.1菌液制备将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代。
3.3.2培养基接种及培养将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7〜10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3〜10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。
每个稀释度接种 3 支试管，置36℃±1℃培养7〜14天，观察培养基变色结果。
3.3.3结果判定：以接种后培养基管数的2 / 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
灵敏度应达到：支原体肉汤培养基：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8；精氨酸支原体肉汤培养基：口腔支原体( ATCC 23714株)应达到10- 4。
3.3供试品检查法3.1干粉培养基及对应菌种产品类型产品名称产品号液体培养基支原体肉汤培养基11109精氨酸支原体肉汤培养基11C21 半流体培养基支原体半流体培养基11A09精氨酸支原体半流体培养基11321 或：琼脂培养基支原体琼脂培养基11C233.2配制半流体培养基（或琼脂培养基) 按照标签处方量配制，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌；在使用前应煮沸10〜15分钟，冷却至56°C左右，然后加人灭能小牛血清（培养基: 血清为8 ：2) ，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。
支原体培养基的灵敏度检测SOP
1. 目的建立支原体灵敏度检测操作规程，保证检测结果的真实可靠。
2. 范围用于自制支原体培养基和外购支原体培养基灵敏度的检测。
3. 职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。
3.2. 质量管理部检验人员：负责本规程的操作。
3.3. 总经理：负责本规程的审批。
4. 定义5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 所需材料6.1.1. 菌种：肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714）购自北京中原公司。
6.1.2. 培养基:6.1.2.1 支原肉汤培养基猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g牛肉浸出液（1：2） 500ml 葡萄糖 5.0g酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g6.1.2.2 支原体半流体培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。
6.1.2.3 支原体琼脂培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。
6.2. 仪器设备无6.3. 器械、用具6.3.1 灭菌玻璃移液管7. 流程图无8. 内容8.1.变色单位试验法：将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后。
将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种到支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。
8.2. 结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
8.3. 液体培养基的灵敏度肺炎支原体（ATCC 15531）应达到10-3，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。
9. 注意事项无10. 附录及派生记录无11. 相关文件无12. 修订记录。
支原体检验及其培养基的质量控制
2.pH值
2.1用pH仪测量pH值
培养基名称 改良Frey氏液体培养基 改良Frey氏固体培养基
支原体液体培养基 支原体固体培养基 无血清支原体培养基 3.无菌检验：应无菌生长。
结果 pH7.6-7.8
培养基质控
4.灵敏度检查和微生物促生长实验
4.1质控菌种及培养基
培养基质控
质控菌种 CVCC菌种编号 ATCC菌种编号
阴性
CO2培养箱
5%CO2 35~37℃ 潮湿的环境
5-7日
标准：如果接种的固体培养基平板上有支原体菌落生长且个数在1-50个之间，且阴性对照没有任何菌落生 长，判定该固体培养基微生物促生长试验符合规定，其他情况判为不符合规定。
支原体检验及其培养基的质控
缪 2020. 09
CONTENTS
目 录
0 检验步骤 1
0 培养基质控 2
1.实验前准备
1) 穿戴好工作服，口罩，帽子和手套。 2) 检查超净工作台上次清场记录，如清场不符合 规定则再行清场处理。 3) 用75%酒精棉，或消毒药水浸湿的纱布，顺着 同一方向对超净台面进行擦拭。 4) 打开超净工作台紫外灯，消毒30 min。 5) 关闭紫外灯，开启风机净化15 min。 6) 将待检样品和培养基移入超净工作台中并摆放整 齐，标记好检品名称，日期和批号。 7) 在检验操作之前，点燃酒精灯，再用75%酒精消 毒双手（手套），将镊子经酒精灯上烤炙灭菌，夹 取酒精棉对样品瓶口表面进行消毒。
检验步骤
2.样品处理
1）每批制品（毒种）取样5瓶。 2）液体制品：混合后备用； 3）冻干制品：加液体培养基或生理盐水复原成混悬液后混合； 4）血清制品：用血清直接接种。
×5
检验步骤
培养基的灵敏度检查名词解释
培养基的灵敏度检查名词解释培养基的灵敏度检查是微生物学中一项重要的实验技术，用于评估和确定某种微生物对特定药物或化合物的敏感程度。
该检查通常用来确定微生物对抗生素、抗菌剂或其他抑菌物质的敏感性，从而帮助医生选择最适合的治疗方案。
本文将对培养基的灵敏度检查进行详细解释，包括其原理、方法和应用范围。
1. 培养基培养基是一种提供营养物质供微生物生长繁殖的物质，它们通常由水、气体、有机和无机化合物组成。
培养基可以分为固体和液体培养基，具体根据实验需求选择。
2. 灵敏度检查灵敏度检查是通过培养微生物在含有不同浓度药物或化合物的培养基上的生长情况来评估微生物对其的敏感程度。
这一方法是通过比较不同浓度的药物或化合物在培养基上对微生物的抑制效果来判断微生物对药物的敏感性。
3. 原理灵敏度检查的原理是基于微生物的生长特性。
在含有抗菌物质的培养基中，微生物的生长受到抑制，这是因为抗菌物质影响了微生物的代谢、细胞壁合成、蛋白质合成等生物学过程。
通过在不同浓度的药物或化合物培养基上培养微生物，可以观察到不同浓度下微生物的生长情况，根据其生长状况判断微生物对药物的敏感性。
4. 方法培养基的灵敏度检查通常采用标准化的方法进行。
首先，将从患者体内或环境中分离的微生物菌株接种于含有不同浓度药物的培养基上。
然后，将培养皿放入恒温培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养一段时间。
观察培养皿中微生物的生长情况，通常通过裸眼观察，也可辅助使用显微镜。
根据微生物在不同药物浓度下的生长情况，可以确定微生物对药物的敏感程度。
5. 应用范围培养基的灵敏度检查在医学领域中具有广泛应用。
首先，在临床诊断中，该检查可以帮助医生选择最适合的抗菌药物，从而提高治疗效果。
其次，在药物研发中，通过灵敏度检查可以评估新药物对微生物的抑制作用，为药物的临床应用提供依据。
此外，在环境监测中，对环境中的微生物进行灵敏度检查可以评估环境中的微生物群落对抗菌物质的变化情况，为环境卫生和生物安全提供参考。
支原体实验室检查方法
支原体实验室检查方法支原体是一种细菌，它可以感染人类身体的上呼吸道，引起诸如咳嗽、头痛、发热和流鼻涕等症状，特别在季节交替时易发生。
支原体是一种使人感到不适和不舒服的病原体，医生可以通过实验室检查来确认诊断。
本文将介绍10种支原体实验室检查方法，并对每种方法进行详细描述。
1. 荧光抗体法检查：通过使用一些特殊的染料和显微镜，医生可以在样本中找到支原体的蛋白质或核酸，并形成荧光物质。
荧光抗体法检查可以在较短时间内完成并具有高度的敏感性和特异性，可以快速预报支原体感染。
此方法适用于多数临床样本，如痰液、血液、尿液和分泌物等。
2. 酶联免疫吸附法检查：该方法主要针对检测支原体抗体的水平，这些抗体可以在感染期间大量产生。
该检查方法可以用于判断患者是否感染了支原体，以及抗体水平是否下降。
适用于血液或其他可采样的体液。
3. PCR检查：聚合酶链反应（PCR）是一种检测支原体核酸的方法，通过特定的引物（primers）扩增目标DNA或RNA序列并进行检测。
此方法适用于病原体数量低，但仍需要高敏感性和特异性的情况，如感染早期检测等。
4. 培养法检查：培养法检查是一种通过将样本置于特定培养基上，让支原体在培养基上繁殖和生长，并观察培养菌落的方法。
此方法适用于体液样本、泌尿生殖道分泌物、眼结膜刮片或鼻咽拭子等检测上呼吸道感染的支原体病原体。
这种方法要求样本具有较高的病原菌数量，结果的敏感性和特异性较低。
5. 饱和浸润法检查：饱和浸润法是一种传统的检测方法，主要使用甲醛或石蜡来固定细胞溶液中的细胞，然后在细胞上染上某种特定的荧光抗体或染色剂，观察结果来确定是否存在支原体。
这种方法的优点是，可以同时检测多种细菌和病毒，但麻烦的是需要较长时间。
6. 银染法检查：银染法是一种直接检验支原体的方法，在样品上使用特定的染剂染色，使得支原体在显微镜下产生银褪色反应。
此方法可以检测多种标本类型，包括痰液、脑脊液、胃液或分泌物等，但结果的敏感性较低。
培养基的灵敏度测试
培育基的灵敏度测试培育基的灵敏度测试是其质量掌握的一个重要检测部分。
方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培育基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。
取预先制备好的琼脂培育基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培育基平皿3~5个（如较闻名的如MERCK,DIFICoL产品）做对比试验，待培育基表面的菌液被琼脂培育基吸干或风干后，将培育皿倒置于培育箱的使用温度下培育48~72小时，（也可采纳浇碟法进行）取出培育后的平皿点计菌落数。
样品培育基上的微生物数量应不得低于对比培育基上微生物生长数量的70%。
否则，需重新检查，或该培育基被视为不符合促生长要求。
2.用于掌握菌检查的富集培育基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查。
每100ml培育基内分别接入试验菌小于100cfu,每个菌种接种两瓶培育基，将接过种的培育基置于指定条件下培育。
应在16~18小时后可明显观看到培育基内有微生物生长，则证明此培育基合格。
原则上无论是采纳脱水培育基还是按相关处方配制的培育基，一旦制成成品培育基，则应对每个配制批号培育基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培育基的质量。
按脱水培育基的生产批号做灵敏度检查是基于培育基的灭菌程序已经经过验证。
假如试验室使用的是商购的成品培育基,供应商应随培育基供应相应批次的培育基质量检测报告，报告包括培育基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。
建议在使用某一新的成品培育基（新供应商或新培育基品种）时，应至少考察三个不同批次的培育基质量，只有三批质量均合格方可使用该培育基。
微生物限度检查用成品培育基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以亚核其质量。
用于无菌检查试验的每批培育基，均必需按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于试验室自行配制的培育基。
支原体药敏试验操作方法
支原体药敏试验操作方法
支原体药敏试验是对支原体细菌进行敏感性测试，以确定它们对不同抗生素的敏感程度。
操作方法如下：
1. 支原体细菌的筛选：首先选择纯化的支原体细菌株，应当检查其纯度和生长状态。
2. 制备试验用平板：使用Mycoplasma agar制备支原体药敏试验的平板，其中包含需要测试的抗生素。
将平板温度调节在35~37之间。
3. 制备菌液：从培养基中收集支原体细菌并转入到PBS缓冲溶液中，用垫头过滤以去除未破裂的细胞。
4. 稀释菌液：将菌液根据需要的浓度逐渐稀释，通常为10^5~10^6 CFU /ml，以便于试验处理。
5. 接种平板：将菌液滴入含有抗生素的药敏试验平板中，用琼脂种培养。
6. 培养：将培养皿放入条件恰当的恒温孵化箱或培养箱中，恒温为35~37，将培养皿培养约3~5天。
7. 判断：在生长完全的区域观察菌落数量、生长状态等信息，根据指南判断其
敏感性和耐药性。
8. 结论：根据支原体所产生的菌落数量和生长状态，分析支原体对药物的敏感性或耐药性。
注意事项：
1. 操作过程中应保证操作环境的无菌性。
2. 需要严格按照试剂及培养基的说明书进行操作。
3. 在菌液制备及接种过程中要严格注意细菌的数量及浓度。
4. 抗生素在试验过程中的使用必须符合相关法律法规。
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支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）
及供试品检查方案
目的：
建立支原体培养基灵敏度检査（变色单位试验法）及供试品检查方案。
范围：
适用于支原体培养基灵敏度检査及供试品检查。
依据：
《中国药典》2015年版
内容:
1、概要：
除药典推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。
2、设备
生化培养箱、生物安全柜。
3、培养基灵敏度检査（变色单位试验法）
3.1干粉培养基及对应菌种
产品号产品名称菌种名称菌种编号11109 支原体肉汤培养基肺炎支原体ATCC 15531株11C21 精氨酸支原体肉汤培养基口腔支原体ATCC 23714株11A09 支原体半流体培养基肺炎支原体ATCC 15531株11321 精氨酸支原体半流体培养基口腔支原体ATCC 23714株
3.2 培养基配制
按照标签处方量配制成液体培养基，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌，待用。
3.3灵敏度检查
3.3.1菌液制备
将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代。
3.3.2培养基接种及培养
将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7〜10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3〜10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。
每个稀释度接种 3 支试管，置36℃±1℃培养7〜14天，观察培养基变色结果。
3.3.3结果判定：
以接种后培养基管数的2 / 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
灵敏度应达到：
支原体肉汤培养基：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8；
精氨酸支原体肉汤培养基：口腔支原体( ATCC 23714株)应达到10- 4。
3.3供试品检查法
3.1干粉培养基及对应菌种
产品类型产品名称产品号
液体培养基支原体肉汤培养基11109
精氨酸支原体肉汤培养基11C21 半流体培养基支原体半流体培养基11A09
精氨酸支原体半流体培养基11321 或：琼脂培养基支原体琼脂培养基11C23
3.2配制
半流体培养基（或琼脂培养基) 按照标签处方量配制，并按标签规定的温度和时间进行湿热灭菌；在使用前应煮沸10〜15分钟，冷却至56°C左右，然后加人灭能小牛血清（培养基: 血清为8 ：2) ，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。
液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
3.3检查
取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4 支、相应的支原体半流体培养基各2 支（已冷至36℃±1℃) ，每支培养基接种供试品0 .5〜1.0ml，置培养21天。
于接种后的第7 天从4 支支原体液体培养基中各取2 支进行次代培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液培养基各2支，置
36℃±1℃培养21天，每隔3 天观察1次。
3.4结果判定
培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
附:供试品检验程序
表:供试品检查程序。