流感疫苗生产用鸡胚蛋质量审计

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疫苗制造中接毒SPF胚蛋成活性无损检测系统

（青岛科技大学自动化与电子工程学院，山东青岛２６６０４２）
摘要：针对人工照蛋法在流感疫苗接毒胚蛋成活性检测中存在的劳动量大、准确性差、检测效率低等缺陷，设计了一种ＳＰＦ（ｓｐｅｃｅｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ，无特定病原体）接毒胚蛋成活性无损检测系统。该系统针对以往研究中胚蛋图像固有光斑噪声无法消除的难题，提出了一种基于ＳＵＳＡＮ（ｓｍａｌｌｅｓｔｕｎｉｖａｌｕｅｓｅｇｍｅｎｔａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇｎｕｃｌｅｕｓ，最小吸收同值核区）算法的光斑噪声检测方
中图分类号：ＴＰ３９１．４；Ｓ１２６文献标志码：Ａ文章编号：２０９５— ２７８３（２０１３）０７— ０７１１ —０６
Ｎｏｎ－ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄＳＰＦｅｇｇｓｉｎｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＬｉｕＣｈｕａｎｌａｉ，ｅｏｆＡｕｔｏｍａｔｉｏｎａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＱｉｎｇｄａｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

流感病毒疫苗原液制备中不同品种胚蛋对原液制备的影响研究

毒对人类也有比较强的致病性，但是到目各阶段与胚蛋质量及产品得率相关的数据
前为止还没有发现因乙型流感病毒而引起进行统计和比对。
的大流行；丙型流感病毒到目前为止只引 1 材料与方法
起人类轻微的上呼吸道感染，相对来说也
用检蛋器检查已经孵育到期的胚蛋，去除死胚、鸡胚生长不良、胚蛋污染等不合格的胚蛋。然后将合格的胚蛋移入冷库冷却。冷却到期后将胚蛋放置于收获机上，收获尿囊液的同时检查是否有不合格胚蛋，收获合格胚蛋的尿囊液。
鸡胚质量如何，是否能达到各项要求就显得十分的重要了。本人所在的公司流感疫苗生产所用胚蛋为海兰白父母代，而近些年由于禽流感疫情经常发生，所以从 2013 年开始国内海关禁止从国外引进活禽，何时解除禁令不得而知，2017 年本公司流感疫苗生产用海兰白父母代鸡胚蛋将无货供应，同时国内的公司这几年来通过不断的
流感流行期，无论成人还是儿童，通常咳嗽和发热是患流感的基本特征 [2-4]，发热一般在 38-40 度范围，但可能会更高。
在前面提到的 3 种类型的病毒中，甲型流感病毒抗原性极其容易发生变异，因此曾引起过多次世界性的大流行 . 在 20 世纪时就爆发了三次流感大流行，分别是
用含有最终浓度为 500_μg/ml 硫酸庆大霉素的 0.01_mol/L 的 PBS 溶液稀释毒种。将胚蛋放到接种机上，每胚接种病毒。接种了病毒的胚蛋置孵，房孵育 50-60 小时。
1.5 收获
1918-1919 年的西班牙大流感、1957-1958 2 批乙型单价病毒原液（共 7 批）进行变
93.50% 1153 251 507 0.60
表1
胚蛋名称海兰白商品代
7.0 93.93%

选择兽用生物制品生产和检验用种蛋及鸡胚应注意的几个问题

选择兽用生物制品生产和检验用种蛋及鸡胚应注意的几个问题滕颖,陈先国(中国兽医药品监察所,北京 100081)[收稿日期]20030213 [文献标识码]B [文章编号]10021280(2003)11005302 [中图分类号]S 859.797[摘要] 针对种蛋的选用、入孵前的清洗和消毒以及对兽用生物制品生产和检验用SPF 鸡胚的品质要求和使用SPF 鸡胚的有关畜牧标准进行了阐述,并对其中应注意的一些问题提出了建议。

[关键词] 兽用生物制品;生产;检验;SPF 鸡胚滕颖(1975年~),女,研究实习员,从事兽用生物制品生产和检验工作。

兽用生物制品作为一种特殊的商品,其质量的优劣直接影响着畜牧业的安全与生产。

兽用生物制品的生产与检验离不开动物性原材料(包括实验动物、鸡胚、动物血清、细胞等)。

本文就种蛋的选用、入孵前的清洗和消毒以及兽用生物制品的生产和检验用SPF 鸡胚的品质要求和使用SPF 鸡胚的有关畜牧标准进行了阐述,并对其中应注意的一些问题提出了建议。

1 鸡胚要有明确的级别标准,生产厂家应严格按标准提供合格的鸡胚蛋源的质量直接关系到疫苗的质量。

按照5中华人民共和国兽用生物制品规程6(以下简称5规程6)2000年版中的有关规定[1],禽用生物制品的生产和检验用种蛋应是SPF 蛋,每批SPF 种蛋均应检验合格,有相关质量检验合格证明。

但部分兽用生物制品生产厂家仍在大量使用非免疫蛋,甚至使用免疫蛋,这就很容易造成蛋源性的疫苗污染。

鸡白痢杆菌病、禽伤寒、禽大肠杆菌病、鸡霉形体病、禽脑脊髓炎、禽白血病、病毒性肝炎等均可由蛋源传播,若使用这样的鸡胚生产疫苗,则疫苗的安全性难以保证。

此外笔者在从事禽用生物制品的生产和检验过程中,有时会在剖检对照SPF 鸡胚时发现鸡胚体左侧有黄色样物质,镜检分析认为是脂肪沉积,但肉眼难以将其与鸡传染性法氏囊病毒造成的肝脏病变区分。

用这种鸡胚作为试验对照会影响试验结果的判定,而生产单位对每个检验胚体都做组织切片镜检是不现实的,这就要求SPF 种蛋生产厂家不仅要对种鸡的饲养加强管理,而且对种鸡的营养水平进行监测,因为蛋鸡的脂肪肝综合症(FLS)具有遗传性的特点,可能会造成SPF 鸡胚脂肪肝[2]。

流感疫苗

流感疫苗的设计题目：甲型H1N1流感疫苗的制造过程姓名：李小刚学院:生命科学技术学院专业：生物技术班级：12级制品学号：2012192018甲型H1N1流感疫苗的制造过程单批疫苗生产需经历病毒接种、病毒培养、病毒灭活、纯化、裂解、配比、分包装及批签发等步骤才能最终投入使用。

1 仪器与材料1.1实验原料鸡胚（海兰白鸡）酒精新洁尔灭苯酚甲醛柠檬三钠生理盐水 5%碘酒1.2实验仪器紫外灯制冷机灭菌柜接种机孵化机滤器电子天平针头蠕动泵层流罩2生产前准备2.1严格选用特定鸡胚鸡胚照检生产流感疫苗，需要准备大量9—10日龄鸡胚。

鸡胚来自海兰白鸡，由专门的公司提供，首先要筛选鸡胚供应商，进行质量审计。

鸡胚具有低抗性甚至无抗性，注入的流感病毒不会被鸡胚自身的抵抗力所杀死。

鸡胚的壳为白色，透光性好，在暗室光源的照射下，可以清晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很容易剔除弱胚、死胚等。

每批送过来的鸡胚要经过严格筛选。

外检共4 项，白壳、大小、破损及脏胚，内检共9 项，去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。

科研人员在进行疫苗种子批制备2.2 毒株需扩增以满足生产需要世卫组织送来的毒种是重组病毒株原始种子，保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病毒的致病力。

不过量比较少，不足以批量生产疫苗，必须对其进行稀释、扩增培养，制备病毒种子批，并验证扩增数据，比如稀释到什么样的浓度培养效果更好。

毒种稀释后，种入鸡胚的尿囊腔中(相当于人胚胎的羊水)，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温的孵化箱中，使病毒快速繁殖。

鸡胚培养一定时间后，抽取尿囊腔里的液体，然后重复培养以获得适宜代次的毒种，保留成为疫苗生产用的种子批。

3大批量生产3.1 大规模培养以获得大量病毒病毒接种生产疫苗所用的鸡胚一次可达到几万枚，病毒大规模的培养和收获过程与获得种子批病毒过程一样，只不过是纯机械化操作，这样可以减少手工污染，并提高生产效率。

高品质SPF种蛋在疫苗生产中的重要性

高品质SPF种蛋在生物制品生产中应用作为畜禽疾病预防控制的有利武器，兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥着越来越重要的作用，极大地促进了畜牧业的繁荣，而畜牧业的发展也带动了兽用生物制品的技术进步和发展。

兽用生物制品的安全问题直接或间接影响人类的生命健康安全，关注与重视兽用生物制品的生物安全，不仅仅是提高和保障动物的健康问题，更重要的是影响和保障人类的生命安全和健康的问题。

生物制品的安全涉及多个方面，其中保证从菌毒种到最终产品的纯净、稳定与安全是一个重要的问题。

其中鸡胚作为生物制品生产的主要原材料，其纯净和安全对生物制品的安全性具有重要的影响。

高品质SPF（Specific Pathogen Free;无特定病原）鸡胚，由于纯净、安全、效价高的特点，已成为生物制品生产的必需原材料，对于保障兽医生物制品的安全起到重要的促进作用。

一、高品质生物制品的质量标准与质量管理我国的兽用生物制品经过数十年的发展已经取得了惊人的进步，无论是从数量上还是质量上的发展速度之快都是难以想象的，最先进的生物技术在兽用生物制品的研究与生产中得到了广泛和充分的应用。

但因其在制造和使用过程中，一旦控制不善，容易对动物和人类造成安全危害，所以政府对其采取严格的管理措施。

可以说安全问题是生物制品生产和使用中最重要的问题，另外优质的生物制品还应具备纯净和有效的特点。

具体地：优质疫苗必须具备以下特点并须通过检测手段以验证其达到标准。

纯净性：必须通过检测验证目标抗原的存在和均一，而不能混有任何其它外源抗原。

这种均一性检测手段包括PCR、HI、形态学方法和生化方法。

外源抗原检测包括鸡胚法或细胞培养接种法、无菌检查、动物接种等。

安全性：检测即确定疫苗产品对于受体动物不造成损害。

一般给于易感动物10倍量免疫，然后检测动物的健康状况，取样然后检测感染情况。

有效性：即确定目标抗原的最小滴度（最小抗原量），以确定每头份的量，这种检测包括CFU计数、EID50、TCID50、蛋白浓度、光密度检查等方法。

深圳市食品药品监督管理局关于开展生产、使用疫苗质量专项检查的通知

深圳市食品药品监督管理局关于开展生产、使用疫苗质量专项检查的通知文章属性•【制定机关】深圳市食品药品监督管理局•【公布日期】2005.07.01•【字号】深食药监安[2005]15号•【施行日期】2005.07.01•【效力等级】地方规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】传染病防控正文深圳市食品药品监督管理局关于开展生产、使用疫苗质量专项检查的通知（深食药监安〔2005〕15号）各有关药品生产企业，市、区疾病预防控制中心，各疫苗接种单位：为贯彻落实国家《疫苗流通和预防接种管理条例》（以下称《条例》），加强疫苗流通和预防接种的管理，预防控制传染病的发生和流行，保障人体健康和公共卫生，根据国家食品药品监督管理局关于在全国范围内立即开展一次疫苗质量专项监督检查的要求，我局决定于7月4日-8日对全市疫苗生产使用情况进行专项监督检查，现将有关事项通知如下：一、国务院制定的《疫苗流通和预防接种管理条例》（以下称《条例》）已于2005年6月1日起正式实施，各单位应认真组织学习，并贯彻落实。

二、立即暂停销售和使用浙江普康生物技术股份有限公司生产的041107、050107、050104、050201、050301、050305等6批次“甲型肝炎减毒活疫苗”（其中041107批次已过期失效）。

三、专项检查内容（见附件自查表）。

四、市食品药品监督管理局将于7月4日至7月15日对有关单位进行抽查。

五、各单位接此通知后，应立即对生产、购入和使用疫苗情况进行一次自查并填写自查表格和疫苗品种名单，对存在的问题及时进行整改，通过检查，进一步提高疫苗各环节的管理水平，防治非法疫苗的使用。

所填写的自查表格和疫苗品种名单，于7月8日前加盖单位公章报送我局安监处。

联系人：李建英、丁波；电话：82002752、82002974，传真：82002751；地址：福田区福中三路市民中心C区1108室，邮编：518035。

附件：1、疫苗生产自查表（生产单位填写）2、疫苗购入、使用自查表（疾病预防控制中心、医疗机构填写）深圳市食品药品监督管理局二○○五年七月一日附件1：疫苗生产情况自查表单位（公章）单位负责人：地址：联系电话：┌────────────────────┬───────────┬───────┐│自查内容│自查结果│备注│├────────────────────┼───────────┼───────┤│本单位生产疫苗的品种数和疫苗的品种名称││品种名单│├────────────────────┼───────────┼───────┤│是否在CMP认证标准的条件下生产│是□否□││├────────────────────┼───────────┼───────┤│所销售的疫苗是否附有药品检验机构依法签发│是□否□│││的生物制品每批检验合格或者审核批准证明复││││印件，并加盖企业印章；│││├────────────────────┼───────────┼───────┤│是否建立真实、完整的购销记录，并保存至超│是□否□│││过疫苗有效期２年备查。

流感裂解疫苗GMP认证检查技术指导原则2009813[1].

流感裂解疫苗GMP检查技术指导原则流感疫苗是预防流行性感冒的有效措施之一，该疫苗能刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防流行性感冒的目的。

流感灭活疫苗在世界范围内已经广泛使用五十多年，目前最常用的是流感裂解疫苗。

流感裂解疫苗系用世界卫生组织（WHO）推荐，并经国家药品监督管理当局批准的甲型（H1N1、H3N2）和乙型流行性感冒病毒当年流行株或相似株，分别接种鸡胚蛋培养、收获的病毒液经浓缩、裂解和纯化后而制成的裂解疫苗。

本指导原则是在执行国家《药品生产质量管理规范》、《药品GMP认证检查评定标准》和国家药品监督管理当局批准的工艺和质量标准前提下，根据流感裂解疫苗的特殊性为便于GMP认证检查提供的一个基本指导原则。

流感裂解疫苗管理方面除在厂房与设施、物料、生产管理、质量管理等方面存在特殊要求外，其余项目均应符合国家《药品生产质量管理规范》、《药品GMP认证检查评定标准》和国家药品监督管理当局批准的工艺和质量标准的要求，以下主要就流感的特殊性方面对检查技术提出基本指导原则。

（一）厂房与设施1.胚蛋预孵孵房与接种病毒后孵房应分开，接种后不同批号的胚蛋应分开，如不同批号的胚蛋在同一孵房中应有防止混淆措施，避免差错。

2.流感生产用孵房（包括预孵孵房）应有洁净级别，至少应达到100，000级。

3.病毒收获、病毒裂解（使用的裂解剂为易燃易爆化学品的）等区域（在生产期间）应保持相对负压。

4.病毒裂解使用裂解剂为易燃易爆化学品的，应在设施、设备选用中充分考虑安全性因素。

（二）物料1. 流感毒株：由于流感病毒容易变异，流感流行的毒株会经常改变，因此WHO 每年要发布当年疫苗生产用毒株的建议。

1.1 流感毒株的来源1.1.1 当年生产用流感毒株的确定——由WHO推荐，来源清楚，应由WHO合作实验室提供。

1.1.2 当年生产用流感毒株相关资料齐全：毒种来源的机构、毒株相关的背景资料、来源的代次、相关购买协议、购买数量等相应的证明性材料。

国家质量监督检验检疫总局关于对禽类制品、消毒、防护用品进行产品质量国家监督专项抽查的通知

国家质量监督检验检疫总局关于对禽类制品、消毒、防护用品进行产品质量国家监督专项抽查的通知文章属性•【制定机关】国家质量监督检验检疫总局(已撤销)•【公布日期】2004.02.13•【文号】国质检监[2004]64号•【施行日期】2004.02.13•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】质量管理和监督正文国家质量监督检验检疫总局关于对禽类制品、消毒、防护用品进行产品质量国家监督专项抽查的通知（2004年2月13日国质检监[2004]64号）各有关省、自治区、直辖市质量技术监督局：为了认真贯彻落实党中央、国务院关于防治高致病性禽流感工作部署，加强对防禽流感相关产品的质量监督，切实保护人民群众身体健康，总局决定组织北京、天津、河北、山西、内蒙古、上海、浙江、安徽、江西、河南、湖北、湖南、广东、广西、云南、陕西、甘肃、新疆等18个省、自治区、直辖市对禽类制品、消毒液、口罩产品进行国家监督专项抽查。

现就专项抽查有关工作通知如下：一、统一思想，明确工作任务。

党中央、国务院对防治高致病性禽流感工作做出了一系列重大决策和部署，各有关省级质量技术监督部门一定要把思想和行动统一到党中央和国务院的部署上来，要以对党、对人民高度负责的态度，增强责任感，认真履行职责，加大监管力度，把防治工作抓实。

一要坚持急事急办，特事特办的原则，尽快部署专项抽查工作；二要打破工作常规，采取“随查随报”的方式，及时上报监督抽查数据、质量较好和较差企业名单；三要按照统一的标准，统一的细则进行抽查；四要坚持监督与服务相结合原则，为企业提供质量标准、计量等技术服务；五要坚持抽查与执法相结合，对发现的制售假冒伪劣产品的违法行为及时查处。

二、抽查范围。

此次专项抽查产品范围包括鸡、鸭、鹅熟禽肉制品；消毒用品(漂白粉、烧碱、高锰酸钾)、消毒液(次氯酸钠、过氧乙酸)；口罩(普通脱脂口罩、医用防护口罩)、防护服等消毒、防护用品。

在专项抽查中要突出重点、严格把关，重点查上述产品质量是否符合有关标准的要求，以及熟肉生产加工企业是否有用疫区禽类产品生产加工熟肉制品的违法行为。

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流感疫苗生产用鸡胚蛋质量审计
编写说明：
1.本模板审计的范围是养鸡场、孵化场。

2.本模板适用于流感疫苗生产企业自检、也可作为其他检查人员参考用。

3.建议企业每年至少一次按照本模板现场考察养鸡场、孵化场的质量管理情况。

4.审计结论应能够反映出养鸡场、孵化场质量管理体系的整体状况，并给予明确的结论。

5.一份记录表格仅适用于一个养鸡场、孵化场的审计。

基本信息
审计对象：
地点：
审计日期：
审计小组人员组成：
姓名：部门
审计主要内容清单：
1.资质
2.机构与人员
3.环境
4.主要的设施设备
5.生产质量管理
6.物料
7.运输
审计结论：
经对上述内容进行审查，供应商管理方面………。

审计报告一、基本信息
审计对象：
地点：
审计日期：
审计小组人员组成：
姓名：部门
审计主要内容清单：
1、资质
2、机构与人员
3、环境
4、主要的设施设备
5、生产质量管理
6、物料
7、运输
二、主要问题及风险评估：
主要问题：
经综合评定养鸡场、孵化场的情况，在保障鸡胚蛋质量、安全方面等管理上存在如下风险：
三、整改建议及跟踪检查结果：
存在问题、整改建议、整改时限建议，是否需再次审计？
四、审计小组成员签字
养鸡场审计记录
孵化场现场审计记录。