转基因克隆牛的研究进展

摘要：转基因动物在畜牧业生产以及生物医学上具有广阔和诱人的应用前景，生产转基因的方法也很多，本文就体细胞核移植生产转基因牛的供体细胞种类、转染方法和转基因牛的应用作一综述，同时也指出了转基因牛存在的不足，并展望了其发展前景。

关键词：牛；转基因；体细胞核移植中图分类号：Ｓ８５２．１文献标识码：Ａ文章编号：１００３－４８８９（２００８）０２－００１４－０５转基因动物实验可追溯到１９７４年，Ｂｒａｃｋｅｔｓ等将兔的精子与ＳＶ４０病毒ＤＮＡ孵育后，进行体外受精获得转基因兔。

同年Ｊａｅｎｉｓｃｈ等将ＳＶ４０病毒ＤＮＡ注射到小鼠胚胎囊腔中，获得携带外源基因的嵌合体小鼠。

１９８０年，Ｇｏｒｄｏｎ等首次报道用原核注射获得了转基因小鼠。

此后，世界各国相继开展转基因动物的研究，美国科学家Ｐａｌｍｉｔｅｒ等（１９８２）将大鼠生长激素（ＧＨ）基因导入小鼠受精卵中获得转基因“超级鼠”，被认为是世界上首批转基因动物。

在１９９１年第１次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第４代技术，被列为生物学发展史１２６年中１４个转折点之一。

１９９７年２月，Ｗｉｌｍｕｔ研究小组在英国《自然》杂志上报告第１例克隆绵羊“多莉”后，转基因动物和克隆技术取得了前所未有的进展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因猴、转基因鱼等都陆续被研制成功。

利用转基因技术建立疾病动物模型与基因治疗动物模型业已成为转基因动物研究的热点，有的已经进入应用阶段。

用转基因技术进行疫苗研究［１］和利用体细胞核移植技术在反刍动物身上进行转基因克隆牛的研究进展邓守龙１，２，吕自力２，陆东林３，王安江１，２（１．新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐８３００２６；２．新疆金牛生物有限公司，乌鲁木齐８３００２６；３．新疆奶业协会，乌鲁木齐８３００１７）作者简介：邓守龙（１９８２－），男，黑龙江人，在读研究生，从事动物繁殖与胚胎工程方面的研究。

收稿日期：２００８－０１－２１!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!经济效益有着重大的影响。

合理地使用含钾、镁和硫的饲料来满足奶牛对这些元素的需要，不仅能预防由于忽视钾、镁和硫常量矿物元素给奶牛带来的各种代谢性疾病，还能够通过合理的搭配和使用来满足奶牛对这些元素的生长生产需要，帮助我们取得良好的经济收益。

参考文献：［１］ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｌ．Ｒ．．ＭｉｎｅｒａｌｓｉｎＡｎｉｍａｌａｎｄＨｕｍａｎＮｕ－ｔｒｉｔｉｏｎ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．１．［２］Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｆ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭａｇｎｅｓｉｕｍＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｏｎｔｈｅＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆＦｏｒａｇｅｓａｎｄＭｉｌｋＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣｏｗｓｗｉｔｈＨｙｐｏｍａｇｎｅｓｅｍｉａ．Ａｎｉｍ．Ｐｒｏｄ．３１：１５３．［３］Ｂｅｅｄｅ，Ｄ．Ｋ．ＰｏｔａｓｓｉｕｍＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＨｅａｔＳｔｒｅｓｓｉｎＬａｃｔａｔｉｎｇＤａｉｒｙＣａｔｔｌｅ．Ｐｒｏｃ．３ｒｄＡｎｎｕａｌ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｉｎｅｒａｌｓＣｏｎｆ．［４］ＮＲＣ．ＮｕｔｒｉｅｎｔＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆＢｅｅｆＣａｔｔｌｅＮａｔｉｏｎａｌＡ－ｃａｄｅｍｙＰｒｅｓｓ．［５］刘庆平，ＤＩＲＫＥ．ＡＸＥ．镁离子（Ｍｇ）营养及其在饲料中的添加．美国Ｍｏｓａｉｃ饲料原料公司．［６］刘庆平，ＤＩＲＫＥ．ＡＸＥ．应激奶牛需要提高日粮钾，镁和钠水平．美国Ｍｏｓａｉｃ饲料原料公司．［７］刘庆平，ＤＩＲＫＥ．ＡＸＥ．镁离子（Ｍｇ）在围产期奶牛营养中的作用．美国Ｍｏｓａｉｃ饲料原料公司．［８］刁其玉．奶牛规模养殖技术．北京：中国农业科学技术出版社［Ｊ］，２００３．［９］李有观．饲料成份与牛奶质量的关系．北京：饲料研究，２０００，（８）：３６～３７．的应用研究［２］也取得重要进展。

最近几年转线粒体（基因）动物［３］的问世进一步拓宽了转基因动物的研究内容。

基因育种、药用家畜已成为当前各国竞相投资研究的热点。

１转基因牛的研究概况牛的基因整合几率低，且世代间隔比其他家畜长，因此转基因牛的生产相对困难。

直到２０世纪９０年代初，美国ＧｅｎｚｙｍｅＴｒａｎｓｇｅｎｅ公司才通过原核显微注射法获得了世界上第１头转基因牛（ＭｃＥｃｏｇ等，１９９０）。

由于牛具有产奶量高等独特优势，因此吸引了不少科学家对其进行研究，尤其是体细胞克隆羊“多莉”诞生后，有关转基因牛获得成功及取得突破的相关报道逐渐增多。

１９９９年，美国科学家首次利用体细胞克隆技术生产出了人类历史上第１头转基因克隆牛；２００２年新西兰与澳大利亚科学家合作也获得了转基因体细胞克隆牛。

２００３年，李宁等培育了１０头体细胞克隆牛。

其中包括两头转基因体细胞克隆牛：“乐娃”和“岩娃”。

“乐娃”转入了绿色荧光蛋白基因，“岩娃”创造了两个世界首次：首次转有人岩藻糖转移酶基因；首次在同一头牛中转有３种外源基因（绿色荧光蛋白基因、人岩藻糖转移酶基因和新霉素抗性基因）。

这一成就标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已经渐趋成熟。

日本研究人员Ｋｕｒｏｉｗａ等（２００４）首次实现了对免疫球蛋白（Ｉｇ）和朊蛋白（ＰＲＮＰ）基因进行依次打靶，获得Ｉｇ单基因位点和双基因位点失活的转基因牛，并提出了依次打靶的策略，可以在不到２年的时间内实现对同一个体两个基因的改造，并获得纯合的克隆牛。

２００５年１０月，世界首例成活的体细胞克隆水牛在广西大学良种牛南方繁殖中心降生，到目前为止，该克隆水牛健康状况良好（翟希等，２００５）；２００６年世界首例抗疯牛病转基因克隆牛在中国山东淄博诞生（董雅娟等）。

转基因牛研究正走向实用化的道路。

２转基因动物的生产原理转基因动物是指通过重组ＤＮＡ技术，用试验导入的方法将外源基因导入生物体内，外源性基因稳定整合在染色体基因组上并传给下一代［４］。

导入的基因称为转入基因，而整个技术则称为转基因技术（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ或ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）。

转基因动物研究大致分为３个部分：上游部分是克隆目的基因，分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究；中游部分是设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等），选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定，在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡，实现对整体动物基因组进行人为修饰的目的；下游部分是按育种程序进行工程动物的选育和建系，在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究，并进一步开发利用符合设计要求的遗传工程动物。

３体细胞核移植生产转基因牛用体细胞核移植生产转基因牛的流程是：先克隆目的基因、分析基因，构建载体系统，再选择适当的供体细胞进行基因转移和鉴定，把外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞，组成重构胚胎，并将所得胚胎移入代孕动物，获得转基因动物克隆个体。

体细胞克隆不同于其它供体细胞，它为转基因技术开辟了新的纪元，事实证明了选择体细胞作供体细胞能生产高比例的转基因后代［５］。

在体细胞核移植生产转基因动物过程中，人们将绿色荧光蛋白导入供体细胞，使重构建的转基因胚胎便于鉴定，通过转绿色荧光蛋白体细胞核移植已生产出了转基因后代小鼠、猪和牛。

利用显微注射法生产转基因牛效率极低，而且成本太高，而通过体细胞核移植技术生产转基因牛则大大提高了转基因生产效率，利用克隆技术生产转基因牛有诸多优点：有利于使用定点表达基因的技术；可以缩短转基因牛及其产品的生产周期；可以预先决定性别。

目前，体细胞克隆技术成功率较低。

该体系的成熟和推广应用依赖于受精卵和核移植卵发育程序的准确启动和精细调控。

可以相信，随着体细胞克隆技术理论的不断完善，该技术必将成为转基因大家畜生产的主要技术。

３．１供体细胞不同体细胞作核供体，现已有９种类型的体细胞后代产生，包括来自成年乳腺上皮细胞，胎儿成纤维细胞，卵丘／颗粒细胞，输卵管／子宫上皮细胞，肌肉细胞，成体耳部成纤维细胞，小鼠尾尖成纤维细胞，睾丸支持细胞，初乳的乳腺上皮细胞。

不同的供体细胞之间，其核移植效率存在着很大的差异。

１９９８年，Ｃｉｂｅｌｌｉ等首次报道用体外培养的携带外源基因的胎儿成纤维细胞进行核移植，获得４头转基因牛，总效率为１．２％；Ｗｅｌｌｓ等用奶牛卵泡颗粒细胞作核供体进行核移植的总效率是２．８％；Ｋｕｂｏｔａ等［６］用牛耳缘皮肤细胞的核移植效率是１．３４％。

迄今为止，体细胞核移植总效率较高的是Ｋａｔｏ等报道的１３．８％，但他们后来研究的总效率也仅为４．０％［７］。

Ｂｅｙｈａｎ等［８］分别用成年牛卵丘细胞、软骨细胞和皮肤成纤维细胞作供核，比较了它们所构建的重组胚在体外的发育能力，发现了皮肤成纤维细胞所构建的重组胚发育能力明显低于其他两种细胞（１３．０％ＶＳ３２．０％；１３．０％ＶＳ２６．６％，Ｐ＜０．０５）。

胎儿耳部成纤维细胞由于分化程度较低，它们所构建的重组胚的发育潜力也就高于成体耳部成纤维细胞所构建的重组胚。

Ｖｉｇｎｏｎ等（１９９９）［９］和Ｋａｓｉｎａｔｈａｎ等（２００１）１０］报道，牛胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成体成纤维细胞。

日本Ｃｉｂｅｌｌ等（１９９８）采用母牛输卵管和子宫内膜细胞为核供体获得了世界首例体细胞克隆牛。

同年，他们以胎儿成纤维细胞为核供体，采用同样的技术方法获得了携带ｐＣ２－ＭＶ／βＧＥＯ（β２半乳糖苷酶）外源基因首例转基因克隆牛。

１９９９年６月１０日，美国康涅狄格大学华裔科学家杨向中等利用１头名叫“艾斯本”的成年奶牛体细胞克隆出“艾米”，因所用核供体的体细胞与生殖系统无关，因此，艾米的诞生具有非同寻常的意义。

２００２年４月１６日“艾米”生下１头健康公犊，证明克隆牛具有正常生育的能力（陆东林，２００３）。

继克隆牛“艾米”之后，Ｙａｎｇ等（２０００）又利用体外长期培养后的公牛耳皮细胞成功克隆出了６头牛犊，这一重要成果打破了科学界认为只有利用新鲜或短暂培养的细胞才可克隆的传统观念，使大批量地克隆牛成为可能。

从此，体细胞核移植技术开始应用于转基因牛的生产中，并获得了抗病或肉奶品质得到改善的转基因克隆牛。

关于外源基因对核移植是否有影响，不同的实验得出的结论不同。

有报道称，转入的外源基因对牛的体细胞核移植有负面影响［１１，１２］。

而Ｒｏｈｅｔ等人报道，将转染了绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）的牛胎儿成纤维细胞进行核移植时，重构胚的体外发育等情况与未转染的细胞无差异［１３］。

３．２转染方法哺乳动物体细胞核移植技术的成功证明动物体细胞的分化不是不可逆的，人们将体外培养传代的体细胞，通过某种方式进行外源基因的转染。

目前，转染的主要方法有：电穿孔法、脂质体法及基因打靶等。

３．２．１电穿孔法在外界高电压短脉冲的作用下改变了细胞膜的结构，使细胞膜产生可逆性电穿孔，使得外源ＤＮＡ通过细胞膜进入细胞，然后将经过筛选的转基因细胞用显微注射法，注入去核的卵母细胞的卵周隙，用电击法使供体核与去核卵母细胞融合，获得转基因重组胚，再经过电激活或化学激活，使重组胚胎发育，在体外或通过中间受体使其发育到囊胚，然后进入同期发育的受体中。