感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
电转感受态细胞的制备
电转感受态细胞的制备电转感受态细胞 (Electroporated sensitized cells) 是指通过电穿孔技术将外源 DNA 或 RNA 导入细胞内的一种技术。
该技术广泛应用于基因治疗、疫苗研究、基因编辑等领域。
本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项。
下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《电转感受态细胞的制备》篇1一、电转感受态细胞的制备方法电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿中，并在适当的条件下培养细胞，使细胞生长至对电穿孔敏感的阶段。
2. 制备电穿孔缓冲液：根据细胞类型和实验需要，选择适当的电穿孔缓冲液，将其制备好。
3. 处理细胞：将细胞与电穿孔缓冲液混合，并在一定条件下进行电穿孔处理。
4. 收集细胞：将处理后的细胞收集到离心管中，并进行离心。
5. 检测细胞：通过荧光显微镜或 Western blot 等方法，检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA。
二、电转感受态细胞的原理电转感受态细胞的原理是利用高电压电流产生的电场，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 或 RNA 通过细胞膜进入细胞内。
电穿孔过程中，细胞膜上的脂质分子重新排列，形成一个暂时的孔道，外源 DNA 或 RNA 通过这个孔道进入细胞内。
三、注意事项在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:1. 细胞选择：不同类型的细胞对电穿孔的敏感性不同，因此需要根据实验需要选择适当的细胞类型。
2. 电穿孔缓冲液：电穿孔缓冲液的组成和浓度对电转感受态细胞的制备非常重要，需要根据实验需要进行优化。
3. 处理条件：电穿孔处理的条件，如电压、电流、时间等，需要根据细胞类型和实验需要进行优化。
4. 检测方法：检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA 的方法需要与实验目的相符，并进行严格的对照实验。
《电转感受态细胞的制备》篇2电转感受态细胞是一种常用于分子生物学和基因工程领域的实验技术，它可以将外源 DNA 或 RNA 转入细胞中，从而实现基因转移和表达。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备（Hanahan法）什么是感受态细胞？野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
制备的关键因素：1.所用转化缓冲液的试剂纯度用高纯度的水和二甲亚砜（DMSO）制备感受态细胞是最重要的，包括细菌培养基在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。
无论何时，尽可能用新买的试剂和生长培养基。
2.细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得的，因此，不应该使用在实验室连续传代或存放于4℃或室温的培养物。
3.玻璃和塑料器皿的清洁微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅的降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini-Q 或相当的水）充满，再经高温高压消毒。
水在玻璃器皿使用前应倒掉。
注意：很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗涤剂的。
材料缓冲液和溶液二甲亚砜DMSODnD溶液（DMSO和DTT）DTT（二硫苏糖醇）1.53gDMSO 9ml1mol/L乙酸甲（PH7.5）100μl 加水补至10mlDnD溶液可用耐受有机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。
转化缓冲液标准的转化缓冲液（TFB）现用现配。
冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞培养基SOB琼脂板含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁和适量的抗菌素SOB培养基含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁SOC培养基每次转化反应需要1ml的SOC培养基核酸和寡核苷酸质粒DNA（重组质粒）离心机和转头Sorvall GSA转头或与之相当的转头专用设备液氮预冷的聚丙烯离心管（50ml）预冷的聚丙烯离心管（17*100mm；Falcom2059）预置的40℃水浴载体和菌种冻存的做转化用的大肠杆菌（该菌种需在-70℃下保存）方法和步骤（重要：本方案中的所有步骤均应在无菌条件下进行）细胞制备1.转化缓冲液的制备若制备立即使用的感受态细胞可用FTB。
感受态细胞常用的制备方法
感受态细胞常用的制备方法常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
?α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
杆菌电转化感受态细胞制备经验过程实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
感受态细胞的制备过程
感受态细胞的制备感受态细胞也叫敏感细胞，它的细胞壁通透性增大，外界物质容易感染进去细胞体里。
目前常用感受态细胞（大肠杆菌）转染质粒载体，而感受态细胞的制备通常是利用0.1M的CaCL来处理，从而让大肠杆菌的细胞壁的通透性增大。
以下为制备感受态细胞的过程：一、试剂：Bacto tryptone (SIGMA Lot. 10k0202)Bacto Yeast Extract (SIGMA Lot. 60k0044)KCL (SIGMA Lot. 129h0080)NaCL (GB 1266-86 AR 广东台山粤侨化工厂)NaOH (GB/T629-1997 AR 广州化学试剂厂)MgSO4.7H2O (GB/T671-1998 AR 广州化学试剂厂)CaCL2（HGB3208-60 AR 广东西陇化工厂）甘油 99+% （SIGMA Lot. 119h0206）二、玻璃器皿：2000ml烧杯（1个）、1000ml量筒（1个）、2.8L三角培养瓶（2个）2L三角培养瓶（3个）、250ml离心管（12个）、试剂瓶（3个）、100ml量筒（1个）、75%酒精棉球三、前处理：配制1N的NaOH与10%SDS（十二烷基苯磺酸钠），对于实验过程中所有用到的玻璃器皿都用1N的NaOH进行泡洗，然后用自来水清洗干净NaOH,再用10%SDS清洗，最后用自来水冲洗7-8遍，并用ddH2O清洗3遍。
四、SOB培养基配方及配制：在本实验中，对于NaCL与KCL、Mg2+等不用母液加，是因为考虑到母液是以前配制，瓶子以及水等都没处理好，故在此实验中是以固体状加进去。
用NaOH调PH7.0，然后定容至3000ml，取40ml培养基装到100ml小三角瓶里作种子液用，其它分装到大三角瓶里（750ml/瓶），称重量并标志。
于1210C灭菌40min。
等温度冷却下来后，对试剂与培养基都进行称重，根据重量差进行补水（灭菌）。
21、1M CaCL2的配制（500ml）：称取CaCL255.49g，溶于ddH2O,定容至500ml，再于0.22μ滤膜上过滤除杂质。
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感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
所以要放于-80摄氏度。
原理：利用化学法CaCl2处理对数生长期的DH5α大肠杆菌或TG1大肠杆菌（-为何选择这两种菌、两种菌的不同处、生长曲线的不同处），使其对外源DNA通透性增加，从而达到外源DNA分子进入细菌的目的。
BL21一般用于外源基因的原核表达，DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增。
TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。
DH5α是扩增菌，BL21是表达菌DH5α可以使质粒高拷贝数扩增，BL21利于蛋白的表达，另外表达菌还有很多，ps系列，roset 系列等DH5α大肠杆菌：此种大肠杆菌，是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。
是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。
试剂：（1）DH5αE.coli菌株——E.coli K-12衍生菌（2）80mM（mmol/L）CaCl2（灭菌）（0.44g→50mL，摇匀；0.88g CaCl2→100mL H2O）（3）液体LB培养基（实验室直接购买现成的，不需要配制）（-浓度是如何确定的这个查查看我没查过看看浓度是否有影响）取250mL三角瓶×2，洗净2.5g→100mLddH2O并摇匀使其溶解后，按1:1000比例加入100μL 1mol/L（1M）NaOH调节至PH7.0 （4）甘油（100%甘油，10mL或20mL）15mL/管×2高温灭菌121℃，20min对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaCl2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。
实验结果表明,不同浓度CaCl2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。
随着CaCl2浓度增高,转化效率也随之提高,在80mmol/L～100mmol/L时达到峰值,进一步提高CaCl2的浓度,转化效率急剧下降。
（CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响王友如(湖北师范学院生物系,湖北黄石435002)）灭菌的准备及试剂配置（1）CaCl2，100mL分装于2个50mL管中，灭菌备用。
（2）甘油，10mL备用灭菌（3）1个Amp—LB固体培养基平板（用于划线，挑去单克隆菌株）（4）100mL Amp—培养基（5）10~20个10mL离心管4~8个50mL离心管感受态细胞的制备（化学CaCl2法）-实验操作中严格灭菌、低温、速度①DH5α菌株在Amp—LB固体培养基平板上划线，37℃培养12—16h，至其长出单克隆菌株。
（-划线作用、培养时间作用）TG1菌株生长速度比DH5α快，只需37℃培养8—12h划线作用用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。
是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
用于目的微生物的分离，便于得到目的性状的单克隆。
培养时间从图1可以看出,重组大肠杆菌DH5α生长的4 个时期区分非常明显。
0~3h为迟缓期,重组大肠杆菌适应新的环境,繁殖的速度很慢;4~9h为对数生长期,此时营养物质很充分,重组大肠杆菌呈对数快速增长;10~16h为稳定期,由于培养基中的营养物质不断地被消耗掉,重组大肠杆菌新陈代谢产生的毒性物质的积累以及pH值下降等因素的影响,重组大肠杆菌繁殖的速度逐渐下降,而死亡的细菌数开始逐渐增加,增殖数与死亡数渐趋平衡,细菌总数处于稳定的状态;17~20h为衰亡期,由于营养物质逐渐减少,而毒性物质越来越多,重组大肠杆菌的繁殖速度就逐渐减缓,死亡菌数明显增多,衰亡的速度超过繁殖的速度,细菌总数就呈现下降趋势。
所以选择培养时间为12—16小时。
②Amp—LB平板上挑取单菌落，轻移至1mL LB Amp—液体培养基中（2mL离心管），37℃220rpm/min，摇床37℃培养8h左右。
③取1mL×2的空白培养基做对照暂存于4度，将1mL 活化菌液全部转移至100mL LB Amp—液体培养基中，37℃，220rpm/min培养2h—3h，使其OD600约等于0.4~0.6（处于对数生长期）（-培养时间可否延长，OD值为何测OD600，其数值可否超过0.6，原因什么）注：测OD值准备-枪、枪头、菌液、空白培养基、ddH2O、纸巾空白对照：第三步去除的空白培养基实验组：摇菌后的菌进行第四步之前准备冰、冰盒、10ml管、菌液全部埋于冰中。
2ml或1.5ml空管放-20℃预冷。
培养时间应该不能延长，死亡细菌数量会增多，造成细菌总量下降。
OD600实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。
在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。
OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。
以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。
测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD600>3表明细菌已经饱和等。
细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。
细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时,此时可以进行转代等研究.在细菌的培养中,OD600超过0.8就要稀释培养液。
不同的菌种的OD600的标准可能不同，对于DH5α而言，OD600值为0.4~0.6为对数生长期。
如果超过0.6的话，细菌的繁殖速度开始下降、生长力下降，一些细菌会老化死亡。
④将培养液置于冰上10min，然后，将菌液分装至10mL管中，3000rpm或4000rpm 4度离心4min—6min，收集细菌沉淀。
⑤弃上清（把剩余菌液吸掉！）用预冷的80mmol/L CaCl2轻轻重悬细菌（轻轻吹打，10次左右），每20mL培养液可用2mL CaCl2重悬，然后，置于冰上冰浴40—60min，3000—4000rpm 4度离心6min—10min，弃上清，保留菌体沉淀。
（-CaCl2作用）⑥每100mL液体培养基对应5—6mL CaCl2/甘油重悬每管1mL或2mL都可CaCl2/甘油溶液为<甘油：CaCl2（80mM）>=<1:4>=<1mL:4mL>（-为何用CaCl2/甘油溶液=1:4保菌有什么说法）⑦感受态细胞置于-80℃或-40℃冰箱保存备用。
用2mL离心管或1.5ml离心管(之前已提前预冷)分装好，离心管要提前置于-20℃预冷。
注：TG1菌株（8h）比DH5α菌株（16h）生长速度快近一倍。
CaCl2作用：增加细胞的通透性细菌处于0℃,CaCl2 的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA 复合物.钙离子的作用是结合于细胞膜上,是细胞膜呈现一种液晶态.在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,使外源DNA进入.甘油作用：保菌一、冷冻保存时菌液会被冻起来，内部产生的“冰晶”会使细胞破裂等，加入如甘油后可以防止对细胞的伤害。
二、简单来说就是抗冻，原理是甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的中浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性。
三、甘油的主要作用就是防止在冻存细菌时产生的冰晶对细胞造成的损害，我们实验室一般用30%的甘油，但保存携带质粒的菌种时甘油浓度要低些，因为甘油浓度太高，质粒就很容。