生物药物分析与检测高效液相色谱法概要
高效液相色谱分析法剖析课件
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。
高效液相色谱法在药物分析领域中的应用
高效液相色谱法在药物分析领域中的应用摘要：对高效液相色谱法在药物含量测定，药物鉴别及添加违禁药物检查中的应用进行了综述。
并展望了高效液相色谱法的发展一联用技术在药物分析中的应用前景。
关键词：高效液相色谱药物分析应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等，是一种高压、高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快的分离分析技术，广泛应用于医学、药学、化学、生化、工业、农业、环保、商检和法检等科学领域。
高效液相色谱法适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。
在中国药典中主要用于药物的含量测定、有关物质检查和鉴别等。
1高效液相色谱法在药物含量测定中的应用天然药物的来源有动物、植物和矿物之分。
由于化学成分复杂，有效成分可能有一个，也可以有多个，因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制，建立质量标准具有重要的意义。
高效液相色谱法可对天然药物的成分进行分离鉴定，并测定有效成分的含量。
葛根素是粉葛药材中的主要活性成分之一，具有扩张冠状动脉、降低血压、减少心肌耗氧量、抗心率失常、降血糖、将血脂、抗动脉硬化、改善微循环、抗肿瘤等多种压力作用。
刘宁采用hplc法测定四川粉葛中葛根素的含量，结果显示该法方简单易行，结果准确，可用于四川粉葛药材的质量控制。
重要复方制剂和化学复合制剂通常含有多种有效成分，各有效成分的含量决定了药物的治疗效果。
高效液相色谱法适合分子量大、难气化、对热敏感等物质的分离分析，因此在中药复方制剂和化学复合制剂的分析中得到了广泛的应用。
秦慧丽等采用高效液相色谱法测定了金麦胶囊中绿原酸含量，结果显示该方法测定样品分离度佳、灵敏度高、操作简便、结果准确可靠。
2hplc在药物鉴别中的应用中药材是加工中药饮片和生产中成药的用原料药，其品种的真伪、质量的优劣直接影响到临床用药的安全有效。
论文 高效液相色谱在药物分析中的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用与发展摘要：色谱分析作为重要的分离分析技术，已成为药物研制开发、生产单位、药品检验部门及医院临床检验等各个领域中药物质量控制必不可少的方法和技术。
高效液相色谱法是20世纪60年代末70年代初出现的分析速度快、分离效率高、操作自动化的新型色谱分析方法。
它已逐渐成为药物分析领域中重要的分析手段及主要制备方式之一。
关键词：高效液相色谱法药物分析1.前言高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography , HPLC），又称“高压液相色谱法”或“高速液相色谱法”，是20世纪60年代末，在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论与实验方法，并加以改进而发展起来的一种重要分离分析方法。
HPLC采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度在线检测器等技术，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、色柱可以反复使用、流动相可选择范围宽、流出组容易收集、适用范围广和安全等优点，特别适合挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离分析测试，广泛应用于医学、药学、化学、生化、工业、农业、环保、商检和法检等科学领域错误!未找到引用源。
近年来，高效液相色谱法在药物分析中发挥着越来越重要的作用，主要是鉴别相关物质、检查药物中有关物质的含量限度以及测定有效成分或主要成分含量，世界各国已将该法收载于药典。
本文就高效液相色谱法在药物分析研究中的应用和发展综述如下。
2.高效液相色谱法在药物分析中的应用2.1高效液相色谱法在药物鉴别中的应用在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别。
如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。
头孢拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。
王维剑[7]王维剑,张军仁,庞华.替莫唑胺含量测定方法的研究[J].药物分析杂志,2003 ,23 (5) :344.等以ODS柱，甲醇-0.5%乙酸(1:9)为流动相，DVD检测器，波长329 nm测定了一种新型抗肿瘤药替莫唑胺(temzolo-mide)，为申报新药提供了数据。
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用(最新整理)
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。
用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。
高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。
与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。
目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。
下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。
一、分类高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。
使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。
在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。
组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。
流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。
（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。
目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。
键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。
按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。
生物药物分析与检验 高效液相色谱
背景
色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett 发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱 子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开， 由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理 论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色 谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC） 等。
色谱法的分类
按流动相状态的不同，可分为 气相色谱法 (GC) 液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱 (SFC)
7
什么是气相色谱法？
以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatography，简称GC 适合分离分析易汽化（在- 190℃-500℃范围内有 0.2-10mmHg的蒸气压的）稳定、不易分解、不易 反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的 分离。
25
检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光 度）与浓度成正比A=lg(1/T)=Kbc 特点： 灵敏度较高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽， 稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（如 蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可 使用 ） 局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小 于检测波长
2．流动相
根据所使用的流动相和固定相的极性程 度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。
正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序是极性小的先流出，极 性大的后流出。
高效液相色谱在生物制药中的应用
高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。
高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。
以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。
于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。
鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。
随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。
高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。
1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。
②高效：分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。
⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。
高效液相色谱有5种类型：1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）2、分配色谱（Partition Chromatography）3、离子色谱（Ion Chromatography）4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）5、亲和色谱（Affinity Chromatography）此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。
高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
高效液相色谱法检测重均分子量_概述及解释说明
高效液相色谱法检测重均分子量概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文主要介绍了高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）在检测重均分子量方面的应用。
重均分子量是指聚合物中各个单体单位的平均摩尔质量，对于聚合物的性能评价尤为重要。
而HPLC作为一种常用的分离和分析方法，具有分离精度高、检测灵敏度高、操作简便等优点，在聚合物领域得到了广泛应用。
1.2 文章结构本文共分为五个部分，包括引言、高效液相色谱法检测重均分子量、实验操作与结果分析、结果讨论与展望以及结论。
引言部分将介绍文章的研究背景和目的，以及文章的结构安排。
随后的各个章节将详细介绍HPLC检测重均分子量的原理、方法步骤和应用领域，并通过实验操作与结果分析进行验证和解释。
最后，在结果讨论与展望部分对实验结果进行深入剖析，并探讨其发展前景和应用推广建议。
结论部分则总结了主要发现和研究意义，同时指出了研究的不足之处和改进方向。
1.3 目的本文旨在全面概述高效液相色谱法在检测重均分子量方面的应用，并探究其优势、方法步骤和应用领域。
通过实验操作与结果分析，验证HPLC在重均分子量检测中的可行性和准确性，并对实验结果进行深入讨论和展望，为相关领域的研究与开发提供参考。
本文的撰写旨在促进对HPLC技术在聚合物领域中的应用和推广，并对未来研究方向提出建议，以推动该领域更加深入细致的研究及产业化发展。
2. 高效液相色谱法检测重均分子量:2.1 原理介绍:高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的化学分析技术，它利用样品在流动液相中的分配行为与固定的固定相之间的相互作用来实现分离和检测。
而重均分子量是指聚合物样品中各个单体单位重量的平均值，是衡量聚合物链长度及其分布的一个重要参数。
因此，高效液相色谱法可以用来准确快速地测定聚合物样品的重均分子量。
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高效液相色谱方法开发 与色谱条件优化
1 了解样品的有关情况，明确分析目的
2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
7a 回收纯化物质
7b 定量校正
7c 定性方法
8 方法论证进入常规实验室
由于HPLC分析不受温度和样品沸点限 制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多 年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、 仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟， 现已成为化学化工、环境、药学、食品等多 个领域中最具优势的分离分析方法之一。
液相色谱仪（4）
2021/2/18
液相色谱仪（5）
Agilent 1100系列
2021/2/18
一、 高效液相色谱仪结构流程
高压泵
进样器
色谱柱
检测器 储液瓶 废液 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器
典型的仪器配置
色 谱 泵 及 控 制 器 数 据 处 理 及 控 制
色 谱 柱 检 测 器
定相颗粒直径多在150-200m范围内。即使这样，流速仍然很
低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但
柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增
加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相
HPLC
分离和分析
柱内径2～6mm，固定相 粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 可以在线检测 分析时间大大缩短
HPLC与GC差别 ✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 ➢ GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
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HPLC常见机型
➢ Waters LC-600 ➢ Waters LC-2690 ➢ 岛津LC－10A ➢ HP1050 ➢ Agilent 1100系列
2021/2/18
液相色谱仪（1）
2021/2/18
液相色谱仪(2)
2021/2/18
液相色谱仪（3）
2021/2/18
泵内。
2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。
W a t e r 1/2/18
Back
HPLC 系统
溶剂传输系统：心脏 样品引入系统： 样品分离系统：关键 信号检测系统： 数据处理系统：
高压泵 进样器 色谱柱 检测器 软件
一 高压输液系统
1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni
合金)，其孔很约2 m，可防止颗粒物进行
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% ➢ HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
HPLC与经典LC区别
HPLC与经典LC区别 ✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
经典LC
仅做为一种分离手段 柱内径1～3cm，固定相 粒径>100μm 且不均匀
常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 无法在线检测 分析周期长
性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
3．操作条件差别
❖ GC：加温操作
❖ HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
2、展望： 1．新型固定相和检测器 2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3．智能化发展
2021/2/18
2021/2/18
Tswett实验
茨维特的实验（图示）
2021/2/18
色谱三要素：
固定相； 流动相； 待分离物质。
2021/2/18
Tswett实验
经典液相色谱法
2021/2/18
第六章
高效液相色谱法
第一节 概述 第二节 基本理论 第三节 高效液相色谱的定性和定量分析 第四节 实际操作中的问题 第五节 在药物分析中的应用
2021/2/18
第一节 概述
1、历史： 1903年 茨维特分离绿叶色素(Tswett实验) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大
柱层析
二、什么是HPLC
高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在 经典液相色谱法的基础上，引入了气相 色谱的理论与高压技术，以高压输送流 动相，采用高效固定相及高灵敏度检测 器，发展而成的现代液相色谱分离分析 方法。
概述 • 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 • 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固
➢ 高柱效——远高于一般LC ➢ 高灵敏度 ➢ 高选择性 ➢ 分析速度快 ➢ 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
建立高效液相色谱分析方法
①根据被分析样品的特性选择适用于样品 分析的一种高效液相色谱分析方法。
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确定 流动相的组成、流速及洗脱方式。