检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论
食品中的氨基酸分析与定量方法研究
食品中的氨基酸分析与定量方法研究氨基酸是组成蛋白质的基本结构单元，也是人体所需的重要营养物质。
因此，对食品中氨基酸的分析与定量方法的研究具有重要意义。
本文将介绍食品中氨基酸的分析方法及一些常用的定量方法，并探讨其优缺点以及在实际应用中的局限性。
一、食品中氨基酸的分析方法1.色谱-质谱联用法色谱-质谱联用法（GC-MS）是目前分析氨基酸最重要的手段之一。
该方法结合了气相色谱和质谱两种技术，能够对氨基酸进行定性和定量分析。
通过GC-MS 技术，可以将食品样品中的氨基酸分离开，并确定其分子结构，从而实现对氨基酸种类和含量的准确测定。
2.高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是另一种常用的氨基酸分析方法。
该方法通过将食品样品中的氨基酸与柱相进行相互作用，实现氨基酸的分离。
同时，通过检测样品在柱相中的吸收或荧光信号，可以测定氨基酸的含量。
HPLC方法具有高分辨率、高灵敏度和操作简便等优点，被广泛应用于食品中氨基酸的定量分析。
3.毛细管电泳法毛细管电泳法（CE）是一种基于电动力学分离原理的氨基酸分析技术。
通过将样品注入毛细管中，施加电场使样品中的氨基酸分离，然后根据各个氨基酸的不同电荷和迁移速度进行定量。
CE方法分离效果好，具有节省试剂和样品等优点，是一种快速、高效的氨基酸定量方法。
二、常用的氨基酸定量方法1.酸水解-衍生化法酸水解-衍生化法是一种传统的氨基酸定量方法。
其基本原理是通过酸水解将食品样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后将氨基酸进行衍生化处理（如使用乙酰胺盐酸盐）以提高检测灵敏度，最后使用色谱法进行定量分析。
该方法不仅能够准确测定食品中各种氨基酸的含量，还可以评估其生物利用率。
2.生化传感器法生化传感器法是一种基于生物传感技术的氨基酸定量方法。
通过将特定酶或抗体固定在传感器表面，并结合光学、电化学等信号转换技术，实现对氨基酸的特异性识别和定量测定。
生化传感器法具有操作简便、灵敏度高和快速分析等优点，已经被广泛应用于食品加工和质量控制中。
实用可行性高蛋白质的测定氨基酸的测定讲义
(3) 滴定：将接收瓶内的硼酸液用0.lmol／L盐酸标 准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白
6. 结果计算：
式中 w——蛋白质的质量分数，%； c ——盐酸标准液的浓度，mol／L； V1——空白滴定消耗标准液量，ml； V2——试样滴定消耗标准液量，ml； m——样品质量，g：
(2) 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢 氧化钠标准溶液继续滴定至pH8.2，记录消耗氢氧化 钠标准溶液毫升数。
(3）取80ml水先用0.05mol／L氢氧化钠调至pH为 8.2，再加入10.00rnl甲醛溶液，用0.05mol／L氢氧 化钠滴定至pH8.2实用，可行做性高试蛋白质剂的测空定氨白基酸的试测 验。
定
5．结果计算
式中w——氨基酸态氮的质量分数，％； V1——测定样品稀释液加入甲醛后消耗标准碱液
的体积，ml； V2——测定空白加入甲醛后消耗标准碱液的体积，
ml； C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
m—— 测定用样实用可品行性溶高蛋液白质的相测定当氨基于酸的测样品的质量，g。 定
实用可行性高蛋白质的测定氨基酸的测 定
(1) 消化
(2) 蒸馏： (3) 吸收与滴定：
实用可行性高蛋白质的测定氨基酸的测 定
2．适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。 3. 仪器
凯氏烧瓶(500mL)、定氮球、漏斗、冷凝管、 锥形瓶、滴定管。
实用可行性高蛋白质的测定氨基酸的测 定
4. 试剂 (1) 浓硫酸 (2) 硫酸钾：提高溶液的沸点，加快有机物的分解。 H2SO4和K2SO4的添加量
或甲基红—亚甲蓝混合指示剂：
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
蛋白质及氨基酸的测定
• 二、蒸馏
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂2~3滴） • 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min
A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
C.吸收
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
•
本法操作简单迅速，适用于测定小麦面粉，糕点， 豆类，蛋黄，及肉制品中蛋白质的含量。 温度对蛋白质水解有影响，操作温度应该控制在 20-30摄氏度之间。 本法由于许多非蛋白质成分在紫外光区有吸收作用， 加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应 用并不广泛。
实验原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或 色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的 磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨 蓝化合物），蓝色的深浅与蛋白质的含量 成正比，可用比色法测定。
当脲被小心加热至150-160℃时，可由两个分子间 脱去一个氨分子而生成双缩脲反应方程式如下：
双缩脲在碱性条件下与少量硫酸铜溶液作用生成 紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应
1.标准曲线的绘制
以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质 样按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、 110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管 中，然后各加上1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至 50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心后的 透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器 零点并测定各溶液的吸光度值A。以蛋白质的含量为横坐标，吸 光度值A为纵坐标绘制标准曲线 2.样品的测定 准确称取适量样品（即使得蛋白质含量在40-110mg之间） 于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在 相同条件下测其吸光度值A。用测得的A值在标准曲线上即可查 得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。
蛋白质氨基酸糖的鉴别试验及其比较
蛋白质1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。
蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。
在540nm 波长处有最大吸收。
可用于蛋白质的定性和定量检测。
紫色络合物分子结构式在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。
双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。
一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。
注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。
双缩脲反应的鉴定由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。
但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！蛋白质检测方法比较糖分的鉴别实验1.Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2 SO4――(NH4)2 SO4(2)(NH4)2 SO4+2NaOH――2H2 O+Na2 SO4+2NH3(3)反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、双缩脲法(biuret法)(一)实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
(二)试剂与器材1.试剂：(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
食品中氨基酸的分析方法和定量测定
食品中氨基酸的分析方法和定量测定氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，对于人体的健康起着重要作用。
因此，食品中氨基酸的分析方法和定量测定是食品科学领域中的一个重要课题。
本文将介绍几种常用的氨基酸分析方法，并探讨其优点和局限性。
1. 紫外光谱法紫外光谱法是一种常用的氨基酸分析方法，它通过检测氨基酸溶液在特定波长下的吸收情况来定量测定氨基酸的含量。
这种方法的优点在于操作简单、快速方便，并且需要的设备简单，成本较低。
但它的局限性在于只能测定氨基酸的总含量，无法对不同种类的氨基酸进行定量测定。
2. 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种常用的氨基酸分析方法，它通过样品与色谱柱中的固定相相互作用，分离出不同种类的氨基酸，并通过检测各种氨基酸在特定条件下的保留时间来定量测定其含量。
这种方法的优点在于可以对不同种类的氨基酸进行定量测定，并且具有较高的灵敏度和准确度。
但它的操作比较复杂，需要较为昂贵的设备和试剂，成本较高。
3. 毛细管电泳法毛细管电泳法是一种基于氨基酸在电场下的迁移速率不同而分离的分析方法，它通过检测氨基酸在毛细管中的迁移时间和峰面积来定量测定其含量。
这种方法的优点在于分离效果好，分辨率高，并且需要的样品量较少。
但它的操作相对复杂，需要特殊的设备和技术，成本较高。
除了上述的几种常用方法之外，还有其他一些新兴的氨基酸分析方法值得关注。
4. 质谱法质谱法是一种基于氨基酸分子的质量-电荷比不同而分离的分析方法，它通过检测样品中氨基酸分子的质量谱图来定量测定其含量。
这种方法的优点在于能够对不同种类的氨基酸进行定量测定，并且具有很高的灵敏度和准确度。
但它的设备成本较高，并且操作复杂，需要有一定的专业知识和技术。
5. 生物传感器法生物传感器法是一种利用生物体内的特定分子与目标物质结合反应产生一定信号来测定目标物质含量的分析方法。
对于氨基酸的定量测定，可以利用特定的酶或菌种来产生与氨基酸结合反应的信号，进而定量测定其含量。
蛋白质氨基酸含量的测定
吸取10.00ml样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室， 以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加 入10ml 400g/L氢氧化钠溶液的使呈强碱性，用少量蒸 馏 水洗漏斗数次，盖塞 ，进行水蒸气 蒸馏。冷凝管下 端 预先插入盛有10mL 4%（或2%)）硼酸吸收液液面 下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记 时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。
硫酸铜 CuSO4
作用 ① 催化剂 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑ Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不 再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝 绿色。 ② 可以指示消化终点的到达。 ③ 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
③ 吸收与滴定 加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待 吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱 酸性（k＝5.8×10-10 ），用酸滴定不影响指示剂的变 色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方 程式：
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
(2) 适用范围 (3)Hale Waihona Puke 器各类食品中蛋白质含量测定
① 500ml凯氏烧瓶 ② 定氮蒸馏装置
(4)试剂
①硫酸铜 ； ② 硫酸钾；③ 硫酸； ④ 40g∕L硼酸溶液： ⑤ 混合指示剂：1g∕L甲基红乙醇溶液与 1g∕L甲基蓝乙醇 溶液，临用时按2：1的比例混合。 或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴甲酚绿乙醇溶液， 临用时按1：5的比例混合； ⑥ 400g∕L氢氧化钠； ⑦0.1mol∕L盐酸 标准溶液
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检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论
蛋白质中氨基酸的含量测定
组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。
蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，其含量测定是生化药品研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前其常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法。
1凯氏定氮法
1．1
方法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量。
本法各国药典收载的方法一致。
故参照《中国药典》2005年版三部[41附录方法，按纯蛋白类供试品及添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品分别拟定各测定方法。
1．2讨论
1．2．1
凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确测定。
1．2．2
本法灵敏度较低，适用于O．2～2．o mg氮的测定，干扰少。
1．2．3
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质的含氮量为16％，故含氮量转化为蛋白质的系数为6．25。
但由于不同蛋白质的结构差异，其换算系数会稍有区别，如乳制品为6．38，动物胶为5。
65等，因此一些特殊蛋白质应在各论中相应说吩其转
化系数。
1．2．4
在本法附注中起草了非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定，一般采用钨酸沉淀法，但当供试品中含有氨基酸(精氨酸)时，由于其会影响蛋白质的沉淀，故建议采用三氯醋酸沉淀法方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0．999以上，较理想；方法(1)试剂配制繁琐且整个实验费时长，而方法(3)操作更简便快速。
按各方法测试后的溶液放置30 min后重新测定其吸光度，3种方法溶液的吸光度均略有降低，结果变异均在1％以内。
根据上述考察结果，故本文参照《国家药品标准》地标升国标制定本法。
2福林酚法(lowry法)
2．1
本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质．铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法各收载的方法中碱陛铜试液的配制、福林酚试液的酸浓度、测定波长及比色条件略有不同。
本文对各种方法的线性、稳定陡进行了考察。
2．2讨论
2．2．1
本法福林酚试液中使用的福林试液贮备液的配制在《中国药典》二部附录中有收载，其酸浓度为2 m01．L～，目前也有市售产品，但酸浓度可能有所差异，故应根据实际福林试液贮备液酸浓度的高低对最终福林酚试液的配制进行调整。
2．2．2
福林-酚试液仅在酸性pH条件下稳定，但第二步的还原反应只在pH=10的情况下发生，故当酚试剂加到碱性铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生，否则会使显色程度减弱。
2．2．3本法干扰物质较多，还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、％s缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
2．3．4本法灵敏度高，比双缩脲法高100倍，通常测定范围为20～250“g。
3双缩腺法
3．1
本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法
测定供试品中蛋白质的含量。
本法各收载的方法中双缩脲试液的配制、测定波长及比色条件略有不同。
本文对各种方法的线性、稳定性进行了考察。
方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0．999以上，较理想；方法(1)溶液的吸光度偏高同时其操作过程中需分别加入两种反应试剂，而方法(3)操作更简便，比色条件为室温。
按各方法测试后的溶液放置30 min后重新测定其吸光度，方法(1)和方法(2)溶液的吸光度略有增加，方法(3)溶液的吸光度基本不变。
3．2讨论
3．2．1加人双缩脲试剂后需立即快速混匀。
3．2．2本法测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，干扰物质较少，干扰测定的物质主要有：硫酸铵、％s缓冲液和某些氨基酸等。
3．2．3本法灵敏度差，测定范围为1～10 mg。
4 2，2’-联喹啉_4，4’-二羧酸法(BCA法)
4．1
本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为cu+，BCA(2，2’一联喹啉4，4’一二羧酸)与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法仅收载于《欧洲药典》6．0版、《英国药典》2009年版与《美国药典》32版附录中且
方法基本一致。
故本文参照国外药典制定本法。
经试验，牛血清白蛋白对照品在84．7～423．6峭浓度范围内线性关系良好，吸光度为0．187～0．907，相关系数为0．999 1。
4．2讨论
4．2．1本法显色后溶液吸光度随时间的增加而明显增加，故溶液显色后应于562 nm的波长处立即测定吸光度。
4．2．2本法干扰物质少。
但样品中不能有还原剂和铜螯合物，否则影响测定。
4．2．3本法灵敏度较高，测定范围为80～400斗g。
5考马斯亮蓝法(Bmdford法)
5．1
本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G笛。
与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照
品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法仅收载于《欧洲药典》6．O 版、《英国药典》2009年版与《美国药典》32版附录中且方法基本一致。
故本文参照国外药典制定本法。
经试验，牛血清白蛋白对照品在1．059～105．9斗g浓度范围内线性关系良好，吸光度为0．005～0．630，相关系数为0．9996。
5．2讨论
5．2．1本法测定吸光度时不可使用石英比色皿(因石英中的二氧化硅会与染色物结合，不易洗去)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95％的乙醇荡洗，以洗去染色。
5．2．2加入考马斯亮蓝G-2S0试剂来回翻转混匀时，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除，干扰测定。
5．2．3本法显色后溶液不稳定，故溶液显色后应于595nm的波长处立即测定吸光度。
主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、七二烷基硫酸钠(SDS)等，样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。
5．2．4本法蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高的吸光系数，吸光度随蛋白质浓度的变化比福林-
酚法要大。
因而灵敏度高，可测定1—200斗g的蛋白浓度∞。
71。
6紫外分光光度法
6．1
本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸：其在280nm波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。
本法《欧洲药典》6．0版、《英国药典》2009年版与《美国药典》32版附录中均收载且方法基本一致，而《中国药典》2005年版未收载该方法，仅在国家药品标准中一些少量品种检查项下用于蛋白质的检查。
本文参照国外药典及相关文献制定本法。
6．2讨论
6．2．1紫外分光光度法测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，但操作简便快速，适用于纯化蛋白质的微量检测，如用于柱层析洗脱液的快速连续检测，测定蛋白质浓度变化而不需要其绝对值或中间体的快速测定。
6．2．2用对照品比较法测定蛋白质含量时，当供试品与对照品中酪氨酸和色氨酸含量差异较大时会产生一定的误差。
故适用于测定与对照蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
6．2．3由于蛋白质吸收峰常因pH值的改变而有所变化，因此要注意溶液的pH值。
6．2．4
蛋白质浓度(mg·mL“)=1．45×A280一0．74×A：∞，此公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。
7小结
7．1蛋白质含量测定方法中各国药典常用的对照品有牛血清白蛋白、人血白蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白及各品种的自身对照品等。
本文采用牛血清白蛋白对各测定方法进行了考察，建议在中国药典各论中应根据品种尽可能选用与品种蛋白质结构相近的蛋白质对照品。
7．2本文建立的蛋白质含量测定方法经六个省市芩暴红止咳口服液的质量标准研究药检所进行了复核，综合各复核意见，收载的六种
蛋白质测定方法的线性、精密度结果均较好。
但由于各测定方法依据的蛋白质反应原理不同，同时由于各品种的蛋白质性质、结构的迥异导致同品种采用不同的测定方法其结果有较大差异。
故建议不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证后再收载在药典各论中。