蛋白质和多肽的氨基酸序列测定
生物化学02第二章 多肽与蛋白质
Glu-Cys-Gly SH
Glu-Cys-Gly S S
Glu-Cys-Gly
谷胱甘肽的生理功用：
• 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其 毒性作用；生物转化。
• 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂， 参与体内多种氧化还原反应；
• 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基 团-SH维持还原状态；
• 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂 对红细胞膜结构的破坏作用。
锌指结构是一个常见的模体。
由一个α-螺旋和两个反向平行的β-折迭组 成，形似手指。
Ｎ－端两个半胱氨酸，Ｃ－端两个组氨酸， 此四个氨基酸残基在空间上构成一个洞穴， 容纳一个锌，具结合锌离子功能。
含锌指结构的蛋白质都可与ＤＮＡ或ＲＮＡ 结合。
锌指结构 (折迭-折迭模序)
亮氨酸拉链结构：
• 见于真核生物DNA结合蛋白质的C端，与 癌基因表达调控有关。
第二章
多肽与蛋白质
Peptides and Proteins
1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，
并将其制成结晶。 19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，
并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年，德国化学家Gerardus J. Mulder引用
2. 蛋白质具有重要的生物学功能
1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递
3. 氧化供能
第一节
肽和蛋白质的一级结构
Primary Structure of Peptides and Proteins
一、肽和蛋白质是由氨基酸组成的多聚体
c端氨基酸序列
c端氨基酸序列
C端氨基酸序列指的是蛋白质或多肽链的羧基端（C端）的氨基酸排列顺序。
C端是蛋白质重要的结构和功能部位，其序列可以影响蛋白质的空间结构和生物学功能。
对C端氨基酸序列进行研究有助于揭示蛋白质的结构和功能，进而为人工合成活性多肽提供依据。
常用的C端氨基酸序列测定方法主要有羧肽酶法、化学法和基于质谱的方法等。
羧肽酶法和化学法是通过酶解法或化学试剂裂解法获得C端氨基酸，再结合液相色谱或质谱技术对氨基酸种类进行鉴定。
而串联质谱法则是将蛋白质样品酶解、消化成肽段混合物，然后对肽段混合物进行串联质谱分析，通过一级质谱信息选择C端肽段离子进行二级质谱分析，再根据二级质谱数据结合相应软件和数据库计算蛋白质的C端氨基酸序列。
(完整版)蛋白质练习题与答案
蛋白质练习题与答案一、选择题1、在寡聚蛋白质中，亚基间的立体排布、相互作用以及接触部位间的空间结构称之谓( )A、三级结构B、缔合现象C、四级结构D、变构现象2、形成稳定的肽链空间结构，非常重要的一点是肽键中的四个原子以及和它相邻的两个α-碳原子处于( )A、不断绕动状态B、可以相对自由旋转C、同一平面D、随不同外界环境而变化的状态3、甘氨酸的解离常数是pK1=2.34, pK2=9.60 ，它的等电点（pI）是( )A、7.26B、5.97 C 、7.14 D、10.774、肽链中的肽键大都是：( )A、顺式结构B、顺式和反式共存C、反式结构5、维持蛋白质二级结构稳定的主要因素是：( )A、静电作用力B、氢键C、疏水键D、范德华作用力6、蛋白质变性是由于（）A、一级结构改变B、空间构象破坏C、辅基脱落D、蛋白质水解7. 氨基酸不具有的化学反应的是（）A.双缩脲反应B.茚三酮反应C.DNFB反应D.PITC反应8、在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转的氨基酸是（）A、丙氨酸B、亮氨酸C、甘氨酸D、丝氨酸9、天然蛋白质中含有的20种氨基酸的结构（）A、全部是L－型B、全部是D型C、部分是L－型，部分是D－型D、除甘氨酸外都是L－型10、谷氨酸的pK’1(-COOH)为2.19，pK’2(-N+H3)为9.67，pK’3r(-COOH)为4.25，其pI是（）A、4.25B、3.22C、6.96D、5.9311、在生理pH情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（）A、ProB、LysC、HisD、Glu12、天然蛋白质中不存在的氨基酸是（）A、半胱氨酸B、瓜氨酸C、丝氨酸D、蛋氨酸13、破坏α－螺旋结构的氨基酸残基之一是：（）A、亮氨酸B、丙氨酸C、脯氨酸D、谷氨酸14、当蛋白质处于等电点时，可使蛋白质分子的（）A、稳定性增加B、表面净电荷不变C、表面净电荷增加D、溶解度最小15、蛋白质分子中-S-S-断裂的方法是（）A、加尿素B、透析法C、加过甲酸D、加重金属盐16、区分极性氨基酸和非极性氨基酸是根据A.所含的羧基和氨基的极性B.所含氨基和羧基的数目C.所含R基团的大小D.脂肪族氨基酸为极性氨基E.所含的R基团为极性或非极性17、有一个肽，用胰蛋白酶水解得：①Met-Glu-Leu-Lys②Ser-Ala-Arg③Gly-Tyr三组片段，用BrCN处理得：④Ser-Ala-Arg-Met⑤Glu-Leu-Lys-Gly-Tyr两组片段，按肽谱重叠法推导出该九肽的序列应为：A.3+2+1B.5+4C.2+1+3D.2+3+1E.1+2+3∙答案：o 1. C 2.C 3.B 4.C 5.B6.B7.A8.C9.D 10.B11.D 12.B 13.C 14.D 15.C16.E 17.C二、是非题1、一氨基一羧基氨基酸的pI为中性，因为-COOH和-NH+3的解离度相等。
蛋白质测序
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求，97%以上，且均一，纯度 鉴定方法。（两种以上才可靠） ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一 条带 ⑵DNS—cL（二甲氨基萘磺酰氯）法 测N端氨基酸
（一） 蛋白质测序的一般步骤
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成。 （4） 断裂链内二硫键。
蛋白质测序的一般步骤
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位置。
2、 测定分子量
用于估算氨基酸残基n= 方法： 凝胶过滤法、 沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方 式： ⑴非共价键结合 8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE测分 子量 ⑵二硫键结合 过甲酸氧化：
—S—S—+HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原：
举例： 血红蛋白 (α2β2)
Location of Disulfide Cross-Bridges
Disulfide bridges typically are cleaved prior to determining the primary structure of a polypeptide. Consequently, the positions of disulfide links are not obvious from the sequence data. To determine their location, a sample of the polypeptide with intact SOS bonds can be fragmented and the sites of any disulfides can be elucidated from fragments that remain linked. Diagonal electrophoresis is a technique for identifying such fragments. (a) A protein digest in which any disulfide bonds remain intact and link their respective Cys-containing peptides is streaked along the edge of a filter paper and (b) subjected to electrophoresis. (c) A strip cut from the edge of the paper is then exposed to performic acid fumes to oxidize any disulfide bridges. (d) Then the paper strip is attached to a new filter paper so that a second electrophoresis can be run in a direction perpendicular to the first. (e) Peptides devoid of disulfides experience no mobility change, and thus their pattern of migration defines a diagonal. Peptides that had disulfides migrate off this diagonal and can be easily identified, isolated, and sequenced to reveal the location of cysteic acid residues formerly involved in disulfide bridges.
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价2.深圳亚辉龙生物科技股份有限公司，广东深圳518000【摘要】氨基酸序列是蛋白质和多肽重要的结构，其决定蛋白质的高级结构。
氨基酸测序在蛋白质研究中越发重要，高分辨率质谱技术的发展大大促进了氨基酸测序的研究。
本文综述了氨基酸测序的方法、原理以及其应用的研究进展，随着质谱技术的不断发展，新的测序方法不断建立，氨基酸测序将在蛋白质研究中发挥更大的作用。
【关键词】蛋白质；氨基酸测序；质谱技术；从头测序蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。
其一级结构是由多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的，二级结构和其它高级结构主要是由非共价力如氢键、离子键、范德华力和疏水作用决定的。
一级结构中氨基酸序列的排列决定蛋白质高级结构的生物学活性。
因此，氨基酸序列测定具有非常重要的意义。
氨基酸序列测定一般需要测定其相对分子质量、等电点、N-末端肽段序列和C-末端肽段序列，虽然测定每种蛋白质的氨基酸序列都有自己特殊的问题需要解决，但是氨基酸测定的一般方法都可以概括为：①测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目；②拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链间的二硫键，如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分；③鉴定多肽链的N-末端残基和C-末端残基，裂解多肽链成较小的片段，测定各肽段的氨基酸序列，目前最常用的肽段测序方法有Edman降解法[1]、酶解法和质谱法；④运用软件重建完整多肽链的一级结构，确定二硫键的位置，利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错拼凑出完整多肽链的氨基酸测序。
目前氨基酸序列测定的方法主要有化学降解法、酶降解法和质谱法以及核苷酸序列的推定法，每种方法都有其自身的优势和劣势，以前面三种测序方法最为常用。
1化学降解法化学降解法是指蛋白质或多肽物质与相应的化学试剂反应后，专一裂解多肽链肽段并检测相关裂解片段的方法，包括N-末端肽段序列测定法和C-末端肽段序列测定法。
蛋白质和多肽的氨基酸序列分析
• 引言 • 蛋白质和多肽的氨基酸组成 • 氨基酸序列分析方法 • 氨基酸序列分析的应用 • 氨基酸序列分析的挑战与展望
01
引言
蛋白质和多肽的定义
蛋白质
由氨基酸组成的大分子，是生命 活动中不可或缺的组成部分，具 有多种生物学功能。
多肽
由2-50个氨基酸组成的短链肽， 具有较低的分子量和稳定性，在 生物体内发挥着重要的生理作用 。
蛋白质相互作用研究
通过分析蛋白质之间的相互作用，可以了解蛋白质在细胞内的功能 和调控机制，为疾病治疗提供新思路。
蛋白质修饰研究
通过对蛋白质的修饰进行分析，可以了解蛋白质的修饰对蛋白质功 能的影响，为药物设计和治疗提供依据。
生物进化研究
物种进化关系研究
通过对不同物种的氨基酸序列进行分析，可以了解物种之间的进 化关系和亲缘关系。
02
蛋白质和多肽的氨基酸组成
常见氨基酸的种类和特性
甘氨酸（Gly）：最简单的氨基酸，无手性碳原 子，呈中性。
01
缬氨酸（Val）：支链氨基酸，呈中性。
03
02
丙氨酸（Ala）：含有三个碳原子的氨基酸， 呈中性。
04
亮氨酸（Leu）：支链氨基酸，呈中性。
异亮氨酸（Ile）：支链氨基酸，呈中性。
05
药物设计与优化
氨基酸序列分析在药物设计 与优化中发挥着关键作用。 通过对靶点蛋白或活性多肽 的氨基酸序列进行分析，可 以发现潜在的药物作用靶点 ，为新药研发提供有力支持 。
生物进化与物种 分类
氨基酸序列分析在生物进化 与物种分类中具有重要价值 。通过对不同物种的蛋白质 和多肽进行氨基酸序列比对 ，可以揭示物种之间的亲缘 关系和进化历程。
氨基酸分析
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。
蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。
蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。
蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。
氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。
并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。
伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。
通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。
设备用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。
当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。
氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。
除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。
检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。
此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。
而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。
一般预防策施在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。
高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。
分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。
所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。
实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。
仪器应放置在实验室的空旷区域。
保持实验室的卫生干净。
根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。
分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色 谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析 的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。
第一节 N端分析原理
一、耦 联 蛋白质和多肽的自由α—氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试
剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容 易断裂。
耦联试剂PITC本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质”。测序完 成
后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)和重复产 率 (repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量， 有时可以推测N端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而 重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有
目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即： ①氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来； ②正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。
其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有 裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍 采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。
过多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。
第六节 C端序列分析
虽然建立在Edman化学法上的自动化N端测序技术日趋成熟，但仍 有不少问题需借助C端序列分析来解决。C端测序尤其适合于基因重组蛋 白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分 析以及DNA探针的设计。
由于选择性对C端羧基进行耦联修饰并从C端逐一将氨基酸残基切下 较N端测序困难，在过去的近20年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致 力于C端测序研究，但目前仍不能和N端测序技术程度媲美。蛋白质化学 工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个 别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。
最近，由于对化学法测定C端技术进行了一系列改进，已有了自动化C 端序列仪问世。所以介绍一种自动化C端测序方法的原理及应用。
第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素
在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单 个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是 由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可 能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95％～98 ％。因此，经过50次循环后，PTH—氨基酸分析谱中将出现较多杂峰， 影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基 酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。
二、裂 解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的
第二个氨基酸残基暴露出自由的α—氨基，又可与PITC进行 耦联反应。
三、转 化 ATZ—氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25％)中可转化
成稳定的PTH—氨基酸。
四、PTH—氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及
质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色 谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确 等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广 泛应用于PTH—氨基酸的鉴定。通常选用C—18反 相柱进行分离。
第二节 N端蛋白质序列仪
三、气相序列仪
自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1～2mg。1978年Tarr 等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测 定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效 地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子
蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长 链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、 卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的 一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸 序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级 结构的信息也有助于对其基因结构的研究。
品量少，通常仅需50～100pmol； ②试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l／10，降低了费用； ③缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。
20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸 以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同
样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世， 蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行
固相序列分析。
在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH—氨基酸衍生物可及时直接 从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH—氨基酸衍生物的定性及 定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一 用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图 4.2为标准PTH—氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分 较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个 别组分位置的迁移及图谱的改善。
①对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂 解效率将更低。
②循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基 分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟 基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端—氨基。 ③另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-{{汀生物也会部分转化成其他产物，造 成产率的降低。