蛋白质和氨基酸测定1(2学时+)资料

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与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受NH4+的影响，但 不能与Pro反应，可以和Cys的-SH反应，为此，TNBS 前，碱性条件下30℃保温数小时，使-SH都氧化成-S-S后，再测定。
碱性条件下测定的优势是可以用420nm，在可见光范 围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下 的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。
常用显色剂：氨基黑10B、溴酚蓝、考马 斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。 另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门的显色 剂。
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第三节 氨基酸定性 一、一般显色反应 茚三酮法：蓝紫色。 二、个别氨基酸的显色反应（略） 精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨 酸的显色反应等。
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第四节 氨基酸定量 一、甲醛滴定法 1、原理 酸性的-COOH，碱性的-NH2，使氨基酸成为中 性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合， 其碱性消失，用碱滴定-COOH基，以间接方法测定 氨基酸的量。 2、大约过程 加碱中和酸（pH 8.2）、加入甲醛，加碱滴 定。当加入甲醛后，溶液的pH值还在8.2吗？当样 品中存在ＮＨ4+时, 则测定结果偏大偏小？如何 25 排除这种影响？
蛋白质含量低大头娃娃
蛋白质含量“高”，肾结石
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2、影响食品色、香、味及结构
面筋蛋白：面包粉≥33%；蛋糕粉: ≤22%馒 头粉25%-30%（ SB/T-93 ）
分黄 为酒 蛋贮 白藏 质中 的 沉 淀 大 部
椰 子 汁 中 蛋 白 加 热 沉 淀
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第一节
蛋白质的定量测定
定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。
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二、比色法
1、茚三酮法 氨基酸与茚三酮生成蓝紫色化合物二酮茚胺，该物在 570nm有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于α氨基被 取代，生成物显黄色440nm有最大吸收）。
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茚三酮反应的适宜pH为5-7
所有α-氨基酸和蛋白质都有此反应，但有此反应的 不一定都是α-氨基酸和蛋白质，比如β-丙氨酸、氨、 许多一级胺与茚三酮都呈阳性。（郑继平，汤华，陈银华 .现代 生物学实验指导. 中国农业出版社，2007.）但色泽不一定一样，比 如，γ-氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（杨桂法等. 有机化学分 析. 湖南大学出版社，1996. ）
EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。
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（2）试剂组成（/hansen/protocols/lowry.htm） Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6• 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folin's Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent) 主要成分为：3H2O•P2O5•13WO3•5MoO3•10H2O 3H2OxP2O5•14WO3•4MoO3•10H2O （ /wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent ）
邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨 基酸产生荧光物质，激发光波长为340nm，发射光波 长为455nm。 灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关， 对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和脯 氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类 似反应。
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3、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acid ）
阮富升. 铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响. 中国调味品. 第8期1999年8月.
甲醛不但与氨基酸的氨基起反应,同时也与ＮＨ4+起反应，增
加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。 因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准 溶液，使氨基氮计算结果升高。 4NH4++ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O
常量凯氏定氮
改良微量凯氏定氮
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（3）滴定
(NH4)2B4O7+HCl+H20→NH4Cl+H3BO3
用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。
指示剂：0.1%甲基红+0.1%溴甲酚绿 终点判定
2%硼酸溶液，蓝绿色→灰色
4%硼酸溶液，蓝绿色→酒红色
主要与混合指示剂的变色范围有关：
pH＜4.0红色 =5.1灰色 ＞6.2绿色
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样品中被恶意添加硫酸铵、氯 化铵，？
样品中被恶意添加硝酸铵，？ 样品中被恶意添加碳酸铵，？
样品中被恶意添加尿素、三聚 氰胺，？
N含量 66.67%
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策略一：甲醛法测定样品消化前铵盐含量 4NH4++ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O
OH六次甲基四胺（弱碱，pH8.7） (NH4+是极弱的酸，不能直接用NaOH滴定）
（于琴，董文宾，赵旭博，郑 丹. 鲜奶中铵盐快速检测新方法
研究.中国乳品工业. 2004，32，8.）
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策略三：非蛋白质有机物物中的N，改用别的方法来测 定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。
三聚氰胺检测（GB/T22388-2008） HPLC（高效液相色谱法）、HPLC-MC、GC-MS HPLC A、提取 超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀 蛋白，离心除杂。 B、净化
丹麦化学家Johan Kjeldahl（1883）发明的，当时只用H2SO4分解试样， 需长时间，后来Gunning改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升从而加快分 5 解速度。后来……
1、原理 其中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而氮转化 为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸 出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。 硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解； 硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂（CuSO
一、凯氏定氮法
奶粉中测得氮含量为2.12%,蛋白质含氮为16%， 奶粉中蛋白质含量? 换算系数通常6.25，牛乳及制品为6.38，大 豆及制品为5.71等。
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H2SO4 脱水性：将H、O按2：1比例脱去，剩下C、N 氧化性： 2H2SO4 + C ＝2SO2↑+ 2H2O + CO2↑
3SO2+2N +3H2O=3SO3 ↑ +2NH3↑ 酸性： H2SO4 +2NH3= (NH4)2SO4
（1）lowry法的原理
色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低，该物质 的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在1100μg/ml时，用750nm或660nm，当蛋白质含量更高 时，用550nm。
没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸
残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定， 铜离子将肽键聚合在一起，从而加速了电子的传递。 干扰物质较多：柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，
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但课本P140所谈及的及GB/T 8314-2002茶游离氨 基酸总量测定时：α-氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮 共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下 测定其含量。
茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化， 使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。
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2、邻苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde ,OPT)
蛋白质和氨基酸测定
思考题 １、硫酸、硫酸铜及硫酸钾在消化中起了什么作用？样
品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？
2、甲醛法测定氨基酸的原理？
3、考马斯亮蓝比色法及Lowry比色法测定蛋白质的原理？
4、茚三酮比色法测定氨基酸的原理及影响因素？
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为何测定蛋白质
1、重要的营养物质
婴幼儿配方乳粉Ⅰ:蛋白质≥18%； （GB10765-1997） 婴幼儿配方乳粉Ⅱ、Ⅲ :蛋白质12-18%； （GB107661997）
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策略二：牛奶中铵盐的定性检测
2NH4+ + 2I- + 2ClO- = NHI2 ↓+ NH3 + 2Cl- + 2H2O
过程：奶样5ml，加入KI约0.25g，缓慢逐滴加入含NaClO5%
的NaOH混合试剂，并同时观察奶样与最后所加试剂两者界 面处的颜色变化，若出现棕灰至黑色浑浊，表明样品掺有铵 盐。
B、吸收 用2%或4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸 没在吸收液中。 C、常量、半微量、微量概念
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常量：＞0.1g，＞10mL； 半微量：0.01g-0.1g ， 1mL-10mL ； 微量：0.1mg-10mg，0.01mL-1mL。 eg:称样0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消 化液，定容至100mL，取其中的10mL蒸馏……
bovine serum albumin ）。
双缩脲法 lowry法
双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在
560nm处有最大吸收。（备注1） 蛋白质-铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残 基使磷钼酸-磷钨酸（Folin phenol reagent）还原成蓝色物质。（备注2） 18
备注1：
双缩脲法
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备注2：
Folin phenol试剂还可以测定酚类物质的含量（郑
鸿元 许光辉 李凤珍等 .土壤微生物分析方法手册. 中国农业出版社，1986.）
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（3）该法的历史
吴宪博士[（1893—1959年）是国际著名生物化学家、中国近代生
物化学事业的开拓者和奠基人]于1922年发现Folin
phenol