食品中氨基酸和蛋白质的测定
食物中氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。
一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。
2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。
本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。
其最低检出限为10pmol。
本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。
用去离子水冲洗干净并烘干。
3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。
4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
4.1浓盐酸：优级纯4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸馏。
4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
食品蛋白质的检测方法
食品蛋白质的检测方法蛋白质是构成食物中重要营养成分之一，对于人体的生长发育、免疫系统的维护以及各种生物化学过程的正常进行起着至关重要的作用。
因此，准确检测食品中蛋白质含量具有重要的意义。
本文将介绍几种常见的食品蛋白质检测方法。
一、生物化学法检测蛋白质生物化学法是一种常见的检测蛋白质含量的方法，它通过测定食品中的氨基酸或肽链来间接推断蛋白质的含量。
该方法的原理是蛋白质分子中含有大量的氨基酸，因此可以通过测定氨基酸的含量来间接计算蛋白质的含量。
常用的氨基酸测定方法有比色法、高效液相色谱法等。
二、免疫学法检测蛋白质免疫学法是一种直接测定蛋白质含量的方法，它利用抗体与特定蛋白质结合的特异性来测定蛋白质的含量。
该方法一般分为免疫沉淀法、免疫层析法和免疫电泳法等。
其中，免疫沉淀法是一种常用的方法，它通过将抗体与待测物质结合，然后通过离心等操作将蛋白质沉淀下来，最后通过比色、荧光或放射性等方法来测定蛋白质的含量。
三、质谱法检测蛋白质质谱法是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质检测方法，它基于蛋白质分子的质量和电荷特性来进行分析。
质谱法可以直接测定蛋白质的分子量和氨基酸序列等信息，对于蛋白质的鉴定和定量具有很高的准确性。
常用的质谱法包括质谱仪、液相质谱法、基质辅助激光解吸电离质谱法等。
四、比色法检测蛋白质比色法是一种简便、快速的蛋白质检测方法，它通过测定蛋白质与染料之间的吸光度差异来推测蛋白质的含量。
该方法常用的染料有布拉德福棕、科尔斯奇蓝等。
比色法操作简单，成本低廉，适用于大规模食品蛋白质含量的快速检测。
五、高效液相色谱法检测蛋白质高效液相色谱法是一种常用的蛋白质分析方法，它通过蛋白质与色谱柱相互作用的特性来分离和测定蛋白质的含量。
该方法可以对蛋白质进行分子量、含量和结构的分析，常用于食品中蛋白质的定性和定量分析。
食品蛋白质的检测方法主要包括生物化学法、免疫学法、质谱法、比色法和高效液相色谱法等。
每种方法都有其独特的优势和适用范围，可以根据实际需要选择合适的方法进行蛋白质检测。
食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定
反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
.
营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
.
.
化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。
197-习题作业-食品中蛋白质和氨基酸的测定 习题作业答案
习题九、食品中蛋白质的测定 答案一、填空题1．新鲜食品中的含氮化合物大都以蛋白质为主体。
2．脱水和氧化；催化剂、指示消化反应的完成、蒸馏时碱性反应的指示剂。
3．防止消化时产生的泡沫溢出瓶外；冷凝管尖端插入液面之下，样品消化液，将冷凝管尖端提离液面。
4．游离氨基酸。
5．使消化液呈碱性，便于氨游离出来，深蓝色或产生黑色沉淀，反应生成氢氧化铜，增加氢氧化钠的用量。
6．与氨基结合使氨基酸的碱性消失。
7．消化、蒸馏、吸收、滴定。
8．少量辛醇或液体石蜡或硅油。
9．澄清透明的蓝绿色。
10．蓝绿色、暗红色。
11．提高溶液沸点。
12．氨基酸，含氮。
13．硼酸。
二、判断题1．× 2．√ 3．√ 4．×三、名词解释1．粗蛋白含量：新鲜食品中含氮化合物大都以蛋白质为主体，凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量的方法。
由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，所以结果为粗蛋白含量。
2．蛋白质系数：每份氮素相当于的蛋白质的份数。
一般蛋白质含氮为16%，所以1份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。
不同种类食品的蛋白质系数不同。
四、问答题1．凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作步骤如何？加入的各种试剂起什么作用？操作过程中有哪些注意事项？原理：样品、浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨逸出，用硼酸溶液吸收后，再以标准盐酸溶液滴定。
根据消耗的标准盐酸液的体积可计算蛋白质的含量。
测定步骤：样品的消化、蒸留、吸收和滴定。
试剂及作用：硫酸铜催化剂和指示剂；硫酸钾提高沸点（4000C）；浓硫酸消化；氢氧化钠溶液蒸留出氨气；硼酸溶液吸收氨气；盐酸标准溶液标定硼酸氨；溴甲酚绿-甲基红指示剂。
注意事项：所用试剂需用无氨蒸馏水配；消化初期先小火防泡沫溢出；蒸馏装置要密封，冷凝管要插入吸收瓶液液面之下；蒸馏结束一定要先撤吸收瓶再关电炉。
食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)
2．合成色素的提取
聚酰胺吸附色素
3．定性分析 14． 定量分析 5 ．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要 求
三、甜味剂的测定
糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味 剂 其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：
1．HPLC法 2．酚磺酞比色法 [原理] 样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提 取分离后，与酚和硫酸在175 ℃作用，生成酚 磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标 准系列比较定量。 [说明] ①本法受温度影响较大，要使糖精充分与 酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在 175士2℃温度下反应 2小时。②苯甲酸等有机 物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱 以排除干扰。 3． 紫外分光光度法
二、蛋白质和氨基酸的分类
三、蛋白质的一般性质
1． 物理性质
2 ．化学性质
第二节 蛋白质的测定
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质 的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质 含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含 量 。 具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内 外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚 试剂法； 国外：红外分析仪
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大 量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制 热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继 续加热消化。 ⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。
[步骤] 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与 滴 定 1.消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4= （NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O
食品理化检验分析 第九章 蛋白质和氨基酸的测定
二、 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
5.计算： 氨基酸态氮=〔 c×（V2-V1）×0.014×100 ） 〕/W×100 V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗 的体积 V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液 消耗量
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。
（二）茚三酮的比色法
原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生 成蓝紫色化合物，可比色定量。（570nm）
一.双缩脲法 1.原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时 ，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络和 物，此反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键（ —CO—NH—），与双缩 脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定 条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分 光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
3．双指示剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.4～10.6）
③ 0.1%中性红 50%乙醇溶液，（6.8～8.0） ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：
取相同两份样品20～30mg→分别于250ml三角瓶→各 加50ml蒸馏水 一份加中性红3滴→用0.1mol/L NaOH 滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚 酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1mol/L NaOH 滴至淡兰色。分别记录两次所消耗的碱液ml数。
食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定
食品分析与检验蛋白质与氨基酸的测定蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验领域中具有重要意义。
蛋白质是食品中重要的营养组分，而氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价食品的品质和安全性具有重要意义。
本文将介绍蛋白质与氨基酸的测定方法及其在食品分析与检验中的应用。
蛋白质的测定方法主要有几种：生物测定法、光谱法和色谱法。
其中，生物测定法主要是通过测定食品中的氮元素含量来间接测定蛋白质含量。
常用的方法有凯氏氮法、造浆法和改良Kjeldahl法等。
光谱法主要是通过根据蛋白质的特征光吸收谱测定其含量。
常用的方法有紫外-可见光谱法、荧光光谱法和红外光谱法等。
色谱法是通过分离和检测蛋白质的各种成分来测定其含量。
常用的方法有凝胶过滤层析法、液相色谱法和气相色谱法等。
氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对于评价蛋白质的营养价值和品质具有重要作用。
氨基酸的测定方法主要有色谱法和生物传感器方法。
其中，色谱法是目前最主要的氨基酸定量方法，其主要包括高效液相色谱法和气相色谱法。
高效液相色谱法常用于氨基酸的定性和定量分析，具有灵敏度高、选择性好和分析速度快的特点；气相色谱法通常用于氨基酸的定性分析，具有高分离能力和分析速度快的优势。
生物传感器方法是一种新兴的氨基酸测定方法，通过利用生物传感器对氨基酸的选择性响应来测定其含量。
生物传感器方法具有灵敏度高、反应快和操作简便等特点。
在食品分析与检验中，蛋白质与氨基酸的测定具有广泛的应用。
首先，蛋白质含量是评价食品营养价值的重要指标之一、通过测定食品中蛋白质的含量，可以评估其蛋白质营养价值和食品质量。
其次，氨基酸是判定食品蛋白质种类和品质的重要指标。
通过测定食品中各种氨基酸的含量，可以评价蛋白质的品质和营养价值。
此外，蛋白质与氨基酸的测定还可以用于食品的伪标问题的检验，如检验食品中是否含有非法添加的蛋白质或氨基酸衍生物。
综上所述，蛋白质与氨基酸的测定在食品分析与检验中具有重要意义。
通过选择合适的测定方法，可以准确、快速地测定食品中的蛋白质含量和氨基酸组成，从而评价食品的品质、安全性和营养价值。
蛋白质氨基酸测定
三聚氰胺(melamine)
是一种有机含氮杂环化合物，学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺， 或称为2,4,6-三氨基－1,3,5-三嗪，简称三胺、蜜胺、氰尿 酰胺，是一种重要的化工原料，主要用途是与醛缩合，生 成三聚氰胺-甲醛树脂，生产塑料，这种塑料不易着火，耐 水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘 性能和机械强度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革、电 器等不可缺少的原料。它还可以用来做胶水和阻燃剂，部 分亚洲国家，也被用来制造化肥。
①样品消化 : 准确称取一定量的样品至干燥洁净的 500mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.5g（1g）、硫酸钾10g （3g)和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→轻轻摇匀，以45º斜 支于石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电 炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加 大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至 液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉， 取下烧瓶、冷却→转移至100mL容量瓶中，加水定容。
❖ 加入硫酸铜的作用 催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。
消化完全指示：蓝绿色；
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66 ％），加之其生产工艺简单、成本很低， 给了掺假、造假者极大地利益驱动，有人 估算在植物蛋白粉和饲料中使蛋白质增加 一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实 蛋白原料的1/5。所以“增加”产品的表观 蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因， 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什 么气味和味道，掺杂后不易被发现等也成 了掺假、造假者心存侥幸的辅助原因。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。
二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。
本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。
通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。
三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。
将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。
2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。
向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。
将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。
用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。
以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。
以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。
五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。
蜂蜜中蛋白质及氨基酸含量的测定
图１ 蛋白质含量的标准曲线图2.2 蜂蜜样品中蛋白质的含量蜂蜜各样品中的蛋白质含量，见表1。
１ 六个蜂蜜样品中的蛋白质含量表/（g/100 g）相对标准偏差/%5平均值0.0430.0460.044±0.002 5.4240.0540.0510.054±0.004 6.4470.3880.3900.391±0.0030.6660.3740.3780.376±0.0030.6940.2220.2250.221±0.003 1.2570.3060.3020.302±0.0030.948以氨基酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。
曲线回归方程为：y=0.001 5x，R2=0.999 1XIANDAISHIPIN109现代食品/图２ 氨基酸含量的标准曲线图表２ 六个蜂蜜样品中的氨基酸含量表氨基酸含量12310.030 40.030 60.030 620.032 20.03160.032 430.048 00.04830.048 740.048 30.04810.047 750.055 10.05470.055 260.054 90.05510.055 9３ 结语从测定结果可知，考马斯亮蓝法和茚三酮显色法分别测定蜂蜜样品中的蛋白质和氨基酸含量，方法的精密度较高。
蜂蜜样品中蛋白质和氨基酸的含量有一定的差别[5]。
作为出口蜂蜜品种，龙眼蜜和荔枝蜜中的蛋白质含量相对较高，两个冬蜜样品中的含量稍低，但氨基酸的含量则相反。
野菊花蜜和山野百花蜜中的蛋白质及氨基酸的含量都极低。
参考文献：让.国家《蜂蜜》标准解读[J].蜜蜂春种一粒粟，秋成万颗子现代食品XIANDAISHIPIN。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
试 剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液
（2）考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝
G250+乙醇+磷酸
测定步骤
（1）标准曲线的绘制
管号
1
100μg/mL牛血 0
清白蛋白标准溶
液的量（mL）
蒸馏水的量（ 1
mL）
蛋白质浓度（ 0
μg/mL）
2
3
4
5
6
0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1
0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0.0
❖测定步骤 （1）标准曲线的绘制
（ 2）样品处理
含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取
含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄， 切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水， 捣成匀浆，称匀浆
液体样品直接吸取
置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭5g，加 热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤， 用30~40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于 100mL容量瓶中，定容，备用。
（mL） pH 8.04磷酸缓 2 冲液（mL） 2% 茚三酮溶 2 液（mL）
1 2 34 200 400 600 800 7 6 54 2 2 22 2 2 22
56 56 1000 1200 32 22 22
混匀，置于沸水浴中加热15min，冷却后 ，用水定容至50mL，静置15min后，在 波长570nm下比色，测定吸光度。以氨 基酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标 ，绘制标准曲线。
放置0.5-1h，以充分提取，而后离心20min， 上清液转入10mL容量瓶中，定容。
（3）测定
吸取提取液0.1mL，分别放入10mL具塞 试管中，加蒸馏水0.9mL，加入5mL考马 斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置2min，于 595 nm下比色，测定吸光度，根据吸光度 从标准曲线上查得待测液中蛋白质含量。
3.蛋白质测定方法
测定蛋白质的方法可分为两大类： ➢一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键
和折射率测定蛋白质含量 ； ➢另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸
性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含 量。
具体测定方法
凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。 快速测定法：双缩脲反应、Folin-酚法、考马斯
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同 。 一般蛋白质平均含氮量为16%，即一 份氮素相 当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白 质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米 ，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46， 大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 5.70，牛乳及其制品为6.38。
2.茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在1h保持稳 定，故应抓紧时间比色。
3.该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水。
无氨蒸馏水制备
方法：普通蒸馏水中加硫酸调至pH<2，使水中各种 形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲 球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。
（三）氨基酸自动分析仪法
原理
利用各种氨基酸的不同性质，使用阳离子 交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的 氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜 色深浅与氨基酸的含量成正比。
（2）样品分析
自动分析仪氨基酸分离图谱
测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面 积计算出氨基酸的精确含量。根据峰出现 的时间可以确定氨基酸的种类。
二、蛋白质的测定
（一）概述
1.蛋白质的生理功用及在食品中的作用
（1）蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组 织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切 有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。 （2）人体的酸碱平衡、水平衡的维持； （3）遗传信息的传递； （4）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 （5）人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物， 来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质； （6）衡量食品的重要营养指标。
食品中氨基酸和蛋白质的测 定
第十章 食品中氨基酸和 蛋白质的测定
一、氨基酸的测定 二、蛋白质的测定
一、氨基酸的测定
（一）概述
➢ 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的 最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸 20种。
➢其中必需氨基酸8种:亮氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色 氨酸和缬氨酸。
成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成 匀浆，称匀浆 液体样品：直接吸取 将样品置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭 5g，加热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌， 过滤，用40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液 备用。
（2）测定
在上述滤液中加入3-4滴酚酞指示剂，用 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅 红色，而后加入中性甲醛20mL，摇匀，浅红 色消失（为什么？）。继续用0.1mol/L氢氧 化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，记录自 甲醛加入后所消耗的0.1mol/L氢氧化钠标准 溶液的体积。
（4）做空白实验
结果计算
式中：C---待测溶液的氨基酸含量（µg） m---样品的质量（g） v1---样品溶液总体积（mL） v2---测定用样品溶液的体积（mL）
说明
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非 常灵敏，测定蛋白质浓度范围为0～ 1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速 测定方法。
氨基酸态 氮的测定
氨基酸总 量的测定
甲醛滴定法 电位滴定法
茚三酮比色法
氨基酸类 型和含量
的测定
氨基酸自动分析仪
（二）食品中氨基酸态氮的测定
1.甲醛滴定法
原理：氨基酸为两性电解质，既含有酸性的 羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水 溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当 加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱 性消失，游离出酸性的羧基，这样就可以用 标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准 溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。
亮蓝G250法、紫外吸收法
（一）考马斯亮蓝法
原 理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当其与蛋
白质结合后变为青色，在一定范围内（01000μg/mL），颜色的深浅与蛋白质含量成正 比，在波长595nm下比色，测定吸光度。
此反应十分迅速，在1h内保持稳定，反应非 常灵敏。
❖仪 器
电子天平
❖紫外-可见 分光光度计
（二）双缩脲法
方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，故在 生物化学领域中测定蛋白质含量时常用 此法； 本法亦适用于豆类、油料、谷类等作 物种子及肉类等样品测定。
原理
在碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2) 能与Cu2+生成紫红色的络合物，这一反应称 为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与 Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与 蛋白质含量在一定范围（1～10mg）内成正 比，可用分光光度计在波长540nm来测其吸 光度，确定含量。
（3）做空白实验
结果计算
式中：C---氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L） V---样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL） V0---空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL） m---样品的质量（g） 0.014 ------氮的毫摩尔质量（g/mmol）
说明及注意事项
1.该方法简便、易行，适用于测定食品中 的游离氨基酸态氮。
2. 食品中的蛋白质含量
动物性食品：如牛肉中蛋白质含量为20.0%， 猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%， 牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%
植物性食品：大豆为40%，稻米 为8.5%，面 粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为 0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为 1.5%左右
样品过滤和定容：水解后的样品取出冷却至室温， 开管后过滤到25mL容量瓶中，水解管用去离子水洗 涤3次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤 纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。 脱酸：吸取样液 1-2mL，置真空脱酸仪上脱酸。温 度 60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止
。
脱酸后的样品，加入 1-2mL 蒸馏水溶 解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸 取少量，通过0.45或0.22µm过滤器过滤 后，上机分析。
操作步骤
（1）样品处理
水解：准确称取固体样品50~200mg，小 心加入水解管中，加入6mol/L HCl 10mL , 酒精喷灯封管后，置烘箱中于110℃水解2224小时。
封管的三种方式：
液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将 水解管直接置液氮中，否则容易冻裂） 真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵 抽力太大，则容易在封管过程中将软化的玻 璃抽碎） 氮吹仪吹氮气15分钟后封管。
20
40
60
80
100
分别向各试管中，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞， 充分混合，放置2min，于595 nm下比色，测定吸 光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标 ，绘制标准曲线。
（2）样品处理
含水量少的固体样品粉碎，称取0.10000.2000g于离心管中，加蒸馏水10mL；
含水量多的固体样品加等量的水捣成匀 浆，称取匀浆2-5g于离心管中，加蒸馏 水6mL；
O
O O
2H2N－C
－NH2
1320 C
H2N－C－N－C－NH2＋
NH3↑ H
尿
双缩脲
素
双缩脲 CuSO4+NaOH 紫红色物
质
❖仪 器
电子天平
❖紫外-可见 分光光度计
❖试 剂
（1）双缩脲试剂 :硫酸铜+酒石酸钾钠
+NaOH
（2）0.05mol/L的NaOH溶液
（3） 5mg/mL标准酪蛋白溶液
说明及注意事项
1.此法适用于测定各类食品中的游离氨基 酸。 2.操作简便，结果准确性高。
（二） 氨基酸总量的测定