蛋白质和氨基酸测定
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食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定
趋势分析
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
❖原理
▪ 考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德 华力结合，使蛋白质染色（蓝色），在595~620nm出呈现 最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。
❖试剂
▪ 牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配 成100g/mL标准溶液。
▪ 染料试剂：称取考马斯亮蓝G250 60mg，溶于100mL3% 过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备 用。
(二)福林酚比色法(Lowry法)
❖ 优缺点
优点
缺点
非常灵敏
反应产生的颜色比双缩脲更易因 蛋白质种类的不同而发生变化
测定结果较少受到样品浑浊的 蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单
影响
糖等会不同程度干扰反应
特异性要高于其他大多数方法
高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基 化合物会干扰
(三) 考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）
(一)双缩脲法(Biuret法)
❖ 肉类样品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）
▪ 测 定 ： 称 取 0.9~1.2g 样 品 于 含 有 20mLNaOH 溶 液 （0.5mol/L）的50mL锥形瓶中，用玻棒搅拌分散，与沸 水浴中加热10min，冰浴冷却；转于到50mL容量瓶中加 水定容。用Whatman 3号滤纸过滤，吸取15mL滤液于 聚乙烯离心管中，加入15~18mL无水乙醚，塞上塞子， 充分振摇，于5820转/min离心，吸取1.0mL下层水相液 体，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，于550nm处读取吸 光是总有机氮，而不只是
析中
蛋白质氮
结果准确
实验时间长（至少2h以上）
可测定样品中微量的蛋白质 试剂有腐蚀性
▪ 考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德 华力结合，使蛋白质染色（蓝色），在595~620nm出呈现 最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。
❖试剂
▪ 牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配 成100g/mL标准溶液。
▪ 染料试剂：称取考马斯亮蓝G250 60mg，溶于100mL3% 过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备 用。
(二)福林酚比色法(Lowry法)
❖ 优缺点
优点
缺点
非常灵敏
反应产生的颜色比双缩脲更易因 蛋白质种类的不同而发生变化
测定结果较少受到样品浑浊的 蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单
影响
糖等会不同程度干扰反应
特异性要高于其他大多数方法
高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基 化合物会干扰
(三) 考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）
(一)双缩脲法(Biuret法)
❖ 肉类样品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）
▪ 测 定 ： 称 取 0.9~1.2g 样 品 于 含 有 20mLNaOH 溶 液 （0.5mol/L）的50mL锥形瓶中，用玻棒搅拌分散，与沸 水浴中加热10min，冰浴冷却；转于到50mL容量瓶中加 水定容。用Whatman 3号滤纸过滤，吸取15mL滤液于 聚乙烯离心管中，加入15~18mL无水乙醚，塞上塞子， 充分振摇，于5820转/min离心，吸取1.0mL下层水相液 体，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，于550nm处读取吸 光是总有机氮，而不只是
析中
蛋白质氮
结果准确
实验时间长（至少2h以上）
可测定样品中微量的蛋白质 试剂有腐蚀性
第3章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2 操作步骤
(2)标准回归方程的测定。分别称取0.050 0～0.120 0g待测定谷物样品20--30个(也 可用蛋白质含量差异大的样品30个左 右)，先用开氏法测出具蛋白质的含量， 然后按上法显色并测定吸收值A，作出标 准回归方程。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 3 备注
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2. 方法特点及应用范围
本法须用开氏法作标准回归方程。本法灵 敏度较低但经试验其与开氏法的相关性较 好，操作简单快速，适用样品广泛，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本 法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品测定，尤适用于大批品种选择用。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 2 操作步骤 （2）氮的测定。用移液管吸取澄清待测液5.00或 10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空 白试验。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 3 说明
（1）本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测 定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂 碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200g·L-1 - 250g·L-1单 宁或100g·L-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶 液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋 白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。
该法为美国谷物化学协会(AACC)测定谷物蛋白质的正式 方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动 分析仪。 一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶 液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会 浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而 异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。 本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室 温20-25℃，须于120～190min内比色；40℃为15-70min显 色稳定；而在60℃连续振荡条件下显色，则反应时间缩短 为5min。 离心须用6 000r·min-1，10min可得澄清液，小于4000r·min-1 的效果不佳。
蛋白质与氨基酸测定
非必需氨基酸
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定
反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
.
营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
.
.
化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。
食品分析第十一章_蛋白质和氨基酸的测定
福林酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法 约小2个数量级。
五、考马斯亮蓝染料比色法
原理：
考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与 蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在 620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。
此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和 小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。
六、染料结合法
m
式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL； V1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； c—盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L； M—N的摩尔质量，14.01g/mol；
m—样品的质量或体积，g； F—氮换算为蛋白质的系数。 一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、 高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71； 肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、 向日葵为5.30。
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的样品．如含赖氨酸、 组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适 当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液 呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧ 蒸馏装置不能漏气。
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 （也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然 后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的 氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非 蛋白氮多的要单测）。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。
合物的最大吸收波长为560nm。
五、考马斯亮蓝染料比色法
原理：
考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与 蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在 620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。
此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和 小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。
六、染料结合法
m
式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL； V1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； c—盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L； M—N的摩尔质量，14.01g/mol；
m—样品的质量或体积，g； F—氮换算为蛋白质的系数。 一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、 高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71； 肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、 向日葵为5.30。
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的样品．如含赖氨酸、 组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适 当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液 呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧ 蒸馏装置不能漏气。
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 （也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然 后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的 氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非 蛋白氮多的要单测）。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。
合物的最大吸收波长为560nm。
蛋白质和氨基酸的测定
24
三、半微量凯氏定氮法
25
三、半微量凯氏定氮法
26
27
计算
X
(V1
V2 ) m
c 10
0.014
F
100%
V
X: 样品中蛋白质的含量，%； V1: 样品消耗盐酸标准液的体积，ml； V2 : 试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml； V: 样品定容总体积，mL; c: 盐酸标准溶液的浓度，mol/L； m: 样品的质量(体积)，g(ml)； F: 蛋白质换算系数; 0.014: mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
❖ 这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程中 带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、 多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者 药品级的添加剂。
通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。
四 蛋白质的快速的测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏 度高、准确，不要大仪器，但费时间，有 害气体污染环境，影响操作人员健康。
收后再用标准盐酸溶液滴定，根据标准酸消耗 量求出含氮量,乘以蛋白质转换系数即为食物中 粗蛋白质含量。
7
整个过程分四步：消化、蒸馏、吸收、滴定
① 消化
将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中 的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2 +12SO2 +16H2O
❖ 目前农业部规定的检测方法， 主要是检查牛奶中是否含有皮革 水解蛋白，这是动物胶原蛋白中 的特有成分，在乳酪蛋白中则没 有，所以一旦验出，则可认为含 有皮革水解蛋白。
三、半微量凯氏定氮法
25
三、半微量凯氏定氮法
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计算
X
(V1
V2 ) m
c 10
0.014
F
100%
V
X: 样品中蛋白质的含量，%； V1: 样品消耗盐酸标准液的体积，ml； V2 : 试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml； V: 样品定容总体积，mL; c: 盐酸标准溶液的浓度，mol/L； m: 样品的质量(体积)，g(ml)； F: 蛋白质换算系数; 0.014: mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
❖ 这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程中 带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、 多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者 药品级的添加剂。
通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。
四 蛋白质的快速的测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏 度高、准确，不要大仪器，但费时间，有 害气体污染环境，影响操作人员健康。
收后再用标准盐酸溶液滴定，根据标准酸消耗 量求出含氮量,乘以蛋白质转换系数即为食物中 粗蛋白质含量。
7
整个过程分四步：消化、蒸馏、吸收、滴定
① 消化
将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中 的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2 +12SO2 +16H2O
❖ 目前农业部规定的检测方法， 主要是检查牛奶中是否含有皮革 水解蛋白，这是动物胶原蛋白中 的特有成分，在乳酪蛋白中则没 有，所以一旦验出，则可认为含 有皮革水解蛋白。
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
4．结果计算
式中
w——氨基酸态氮的质量分数；
C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
V1——用中性红作指示剂滴定消耗氢氧化钠标 准溶液的体积，ml；
V2——用百里酚酞作指示剂滴定消耗氢氧化钠 标准溶液的体积，ml； 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
m—— 测定用样品溶液相当于样品的质量，g。
思考题：
1．为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量 为粗蛋白含量?
2．在消化过程中加入的硫酸铜试剂有哪些作用?
3．样品消化过程中内容物的颜色发生什么变化?为什 么?
4．样品经消化进行蒸馏之前为什么要加入氢氧化钠？ 这时溶液的颜色会发生什么变化?为什么?如果没有变 化，说明了什么问题?须采取什么措施？ 5．蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要用硫 酸调成酸性? 6．蛋白质测定的结果计算为什么要乘上蛋白质系数?
(5) 混合指示剂
甲基红—溴甲酚绿混合指示剂： 5份2g/L溴甲酚绿95％乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙 醇溶液混合均匀。终点为灰红色。 或甲基红—亚甲蓝混合指示剂：
一体积的亚甲蓝（0.05%酒精溶液）和二体积的甲 基红指示剂（0.05%酒精溶液）的混合物。终点为紫色。
(6) 饱和硼酸溶液（40g/L）： 称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。 (7) 0.1N盐酸标准溶液
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述 第二节 蛋白质的测定方法 第三节 氨基酸态氮的测定
第一节 概述
一、pro组成与蛋白质系数 1．组成 pro是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大 分子化合物。
元素组成百分比：
元素 C H O N S P
百分比 50 7 23
16
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2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
第13页/共72页
④ 滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定 蓝绿色→灰红色
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
第14页/共72页
2、操作方法 （1）样品消化
瓶口不能对着人
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加
第22页/共72页
④ 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试 剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
热微沸30分钟
盖上小漏斗
样品+0.5g硫 酸铜+10g硫 消酸化钾终+点20mL 浓硫酸+玻珠 数粒
45度角
第15页/共72页
消化炉
第16页/共72页
氨全部蒸出后，提 离页面，蒸馏水冲 洗，继续蒸馏1min。 奈氏试剂检验
50mL，40g/L 的硼砂以及混 合指示剂
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70-80mL， 400g/L氢氧化 钠溶液
2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
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❖加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有 机物的分解（3380C 4000C）
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会 引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点， 但效果不如硫酸钾。
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② 蒸馏
在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH4)2 SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀
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③ 吸收
用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微 弱酸性（Ka1=5.8X 10-10），与氨形成强碱 弱酸盐
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米， 荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95， 大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为 6.38。
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四、蛋白质分析的重要性
• 评价食品的营养价值 • 优化食品配方 • 述
一、蛋白质的元素组成
C：50-55% N：15-18% O：20-25% H：5-7% S：0.2-0.3% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
二、基本结构单位：氨基酸
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三、蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故 各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮 量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值 （6.25）称为蛋白质系数。
装有消化液； 加入氢氧化钠 后要求颜色变 为深蓝色或产 生黑色沉淀
奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕
检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色 沉淀。
配制方法1： 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。 加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必 要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。
包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。
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① 样品消化
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O
浓硫酸的作用： 脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸 则被还原成二氧化硫
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❖加入硫酸铜的作用
催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋
SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 消化完全指示：蓝绿色；
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滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。
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改良式定氮蒸馏器
半微量定氮蒸馏器
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注意问题：
① 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈； ② 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注
意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附 在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全； ③ 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少 量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化 过程中产生大量泡沫；
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一、凯氏定氮法
➢ 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质 系数而求出蛋白质的含量
➢ 此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少 量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类 脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物
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（一）常量凯氏定氮法 1、原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解， 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机 氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸 出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标 准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
配制方法2：溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许 水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去 沉淀，储存于棕色瓶中。
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（3）滴定
①用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂） 国标用亚甲基兰+甲基红。
②用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
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五、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
利用特定氨基酸残基法
福林酚法 染色法
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第二节 凯氏定氮分析法
蛋白质测定方法
凯氏定氮法 双缩脲法
紫外吸收法 福林-酚试剂法
水杨酸比色法 近红外光谱法
折光法
旋光法
➢ 目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法
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④ 滴定 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定 蓝绿色→灰红色
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
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2、操作方法 （1）样品消化
瓶口不能对着人
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加
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④ 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试 剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
热微沸30分钟
盖上小漏斗
样品+0.5g硫 酸铜+10g硫 消酸化钾终+点20mL 浓硫酸+玻珠 数粒
45度角
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消化炉
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氨全部蒸出后，提 离页面，蒸馏水冲 洗，继续蒸馏1min。 奈氏试剂检验
50mL，40g/L 的硼砂以及混 合指示剂
第17页/共72页
70-80mL， 400g/L氢氧化 钠溶液
2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
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❖加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有 机物的分解（3380C 4000C）
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会 引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点， 但效果不如硫酸钾。
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② 蒸馏
在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH4)2 SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀
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③ 吸收
用硼酸溶液，并加入混合指示剂，硼酸呈微 弱酸性（Ka1=5.8X 10-10），与氨形成强碱 弱酸盐
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米， 荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95， 大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为 6.38。
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四、蛋白质分析的重要性
• 评价食品的营养价值 • 优化食品配方 • 述
一、蛋白质的元素组成
C：50-55% N：15-18% O：20-25% H：5-7% S：0.2-0.3% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
二、基本结构单位：氨基酸
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三、蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故 各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮 量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值 （6.25）称为蛋白质系数。
装有消化液； 加入氢氧化钠 后要求颜色变 为深蓝色或产 生黑色沉淀
奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕
检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色 沉淀。
配制方法1： 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。 加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必 要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。
包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤。
第8页/共72页
① 样品消化
2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O
浓硫酸的作用： 脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N 氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸 则被还原成二氧化硫
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❖加入硫酸铜的作用
催化作用：加速有机物的氧化分解 C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋
SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫 酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 消化完全指示：蓝绿色；
第19页/共72页
滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。
第20页/共72页
改良式定氮蒸馏器
半微量定氮蒸馏器
第21页/共72页
注意问题：
① 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈； ② 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注
意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附 在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全； ③ 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少 量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化 过程中产生大量泡沫；
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一、凯氏定氮法
➢ 是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质 系数而求出蛋白质的含量
➢ 此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少 量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类 脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物
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（一）常量凯氏定氮法 1、原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解， 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机 氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸 出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标 准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
配制方法2：溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许 水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去 沉淀，储存于棕色瓶中。
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（3）滴定
①用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂） 国标用亚甲基兰+甲基红。
②用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
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五、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
利用特定氨基酸残基法
福林酚法 染色法
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第二节 凯氏定氮分析法
蛋白质测定方法
凯氏定氮法 双缩脲法
紫外吸收法 福林-酚试剂法
水杨酸比色法 近红外光谱法
折光法
旋光法
➢ 目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法