蛋白质及氨基酸的测定
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食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定
趋势分析
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
第九章 蛋白质和氨基酸的测定
❖原理
▪ 考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德 华力结合，使蛋白质染色（蓝色），在595~620nm出呈现 最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。
❖试剂
▪ 牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配 成100g/mL标准溶液。
▪ 染料试剂：称取考马斯亮蓝G250 60mg，溶于100mL3% 过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备 用。
(二)福林酚比色法(Lowry法)
❖ 优缺点
优点
缺点
非常灵敏
反应产生的颜色比双缩脲更易因 蛋白质种类的不同而发生变化
测定结果较少受到样品浑浊的 蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单
影响
糖等会不同程度干扰反应
特异性要高于其他大多数方法
高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基 化合物会干扰
(三) 考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）
(一)双缩脲法(Biuret法)
❖ 肉类样品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）
▪ 测 定 ： 称 取 0.9~1.2g 样 品 于 含 有 20mLNaOH 溶 液 （0.5mol/L）的50mL锥形瓶中，用玻棒搅拌分散，与沸 水浴中加热10min，冰浴冷却；转于到50mL容量瓶中加 水定容。用Whatman 3号滤纸过滤，吸取15mL滤液于 聚乙烯离心管中，加入15~18mL无水乙醚，塞上塞子， 充分振摇，于5820转/min离心，吸取1.0mL下层水相液 体，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，于550nm处读取吸 光是总有机氮，而不只是
析中
蛋白质氮
结果准确
实验时间长（至少2h以上）
可测定样品中微量的蛋白质 试剂有腐蚀性
▪ 考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德 华力结合，使蛋白质染色（蓝色），在595~620nm出呈现 最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。
❖试剂
▪ 牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配 成100g/mL标准溶液。
▪ 染料试剂：称取考马斯亮蓝G250 60mg，溶于100mL3% 过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备 用。
(二)福林酚比色法(Lowry法)
❖ 优缺点
优点
缺点
非常灵敏
反应产生的颜色比双缩脲更易因 蛋白质种类的不同而发生变化
测定结果较少受到样品浑浊的 蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单
影响
糖等会不同程度干扰反应
特异性要高于其他大多数方法
高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基 化合物会干扰
(三) 考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）
(一)双缩脲法(Biuret法)
❖ 肉类样品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）
▪ 测 定 ： 称 取 0.9~1.2g 样 品 于 含 有 20mLNaOH 溶 液 （0.5mol/L）的50mL锥形瓶中，用玻棒搅拌分散，与沸 水浴中加热10min，冰浴冷却；转于到50mL容量瓶中加 水定容。用Whatman 3号滤纸过滤，吸取15mL滤液于 聚乙烯离心管中，加入15~18mL无水乙醚，塞上塞子， 充分振摇，于5820转/min离心，吸取1.0mL下层水相液 体，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，于550nm处读取吸 光是总有机氮，而不只是
析中
蛋白质氮
结果准确
实验时间长（至少2h以上）
可测定样品中微量的蛋白质 试剂有腐蚀性
第3章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2 操作步骤
(2)标准回归方程的测定。分别称取0.050 0～0.120 0g待测定谷物样品20--30个(也 可用蛋白质含量差异大的样品30个左 右)，先用开氏法测出具蛋白质的含量， 然后按上法显色并测定吸收值A，作出标 准回归方程。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 3 备注
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2. 方法特点及应用范围
本法须用开氏法作标准回归方程。本法灵 敏度较低但经试验其与开氏法的相关性较 好，操作简单快速，适用样品广泛，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本 法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品测定，尤适用于大批品种选择用。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 2 操作步骤 （2）氮的测定。用移液管吸取澄清待测液5.00或 10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空 白试验。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 3 说明
（1）本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测 定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂 碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200g·L-1 - 250g·L-1单 宁或100g·L-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶 液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋 白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。
该法为美国谷物化学协会(AACC)测定谷物蛋白质的正式 方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动 分析仪。 一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶 液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会 浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而 异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。 本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室 温20-25℃，须于120～190min内比色；40℃为15-70min显 色稳定；而在60℃连续振荡条件下显色，则反应时间缩短 为5min。 离心须用6 000r·min-1，10min可得澄清液，小于4000r·min-1 的效果不佳。
蛋白质与氨基酸测定
非必需氨基酸
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
人体可以自行合成，不必从食物中摄取的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸等。
氨基酸的功能
合成蛋白质
合成其他生物活性物质
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，通 过脱水缩合形成肽链，进而形成蛋白 质。
氨基酸可以作为合成其他生物活性物 质的原料，如嘌呤、嘧啶等。
代谢调节
氨基酸参与多种代谢反应，如糖代谢、 脂肪代谢和氮代谢等，对维持人体正 常生理功能具有重要作用。
生物能源研究
蛋白质和氨基酸在生物能源领域也有应用，如通过测定蛋 白质的分解产物来评估生物燃料的生产效率和可持续性。
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蛋白质含量。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度来测 定蛋白质含量，如双缩脲法、 酚试剂法等。
色谱法
利用色谱技术分离蛋白质，通 过测定各组分的含量来计算蛋 白质含量。
质谱法
通过测定蛋白质的质荷比来鉴 定蛋白质，常用于蛋白质组学
研究。
02
氨基酸测定
氨基酸的种类
必需氨基酸
人体无法自行合成，必须从食物中摄取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和组氨酸。
蛋白质在生物体内可以水解成氨基酸， 氨基酸通过合成反应形成蛋白质。
蛋白质与氨基酸在生物体内的代谢过程
蛋白质的合成与分解
在生物体内，蛋白质的合成和分解是 一个动态平衡的过程。合成主要发生 在细胞内的核糖体上，而分解则通过 蛋白酶的催化作用进行。
氨基酸的代谢
氨基酸在生物体内经过一系列的代谢 反应，可以转化为其他有机物质，如 葡萄糖、脂肪等。同时，氨基酸也可 以作为合成核苷酸、激素等物质的原 料。
食品中一般成分分析—蛋白质和氨基酸的测定
反应原理
电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。 在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往变 化很大，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过 消耗滴定剂的量来计算。
反应原理
因此，电位滴定准确度和精密度高，可用于滴定 突跃小或不明显的滴定反应，也可用于有色或浑浊试 样的滴定，电位滴定装置简单、操作方便，可自动化。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定， 氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。
食品中通常含有多种氨基酸，因此需要测定氨基酸的总 量，不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的 氮即氨基酸态氮的百分率来表示。
氨基酸含量一直是某些发酵产品如调味品的重要质量指 标，也是目前许多保健食品的质量指标之一。
与蛋白质中氨基酸结合状态不同，呈游离状态的氨基酸 的含氮量可直接测定，因此称为氨基酸态氮。
.
营养学分类
（2）半必需氨基酸或条件必需氨基酸 人体虽能够合成精氨酸和组氨酸，但通常不能满足 正常的需要，因此，又被称为半必需氨基酸或条件必需 氨基酸，在幼儿生长期这两种是必需氨基酸。 （3）非必需氨基酸 指能由简单的前体合成，不需要从食物中获得的氨 基酸。例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。
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化学结构分类
仪器及试剂
仪器及试剂
1.仪器 分光光度计、容量瓶、具塞刻度试管、移液管、恒温水浴锅等； 2.试剂 （1）20g/L茚三酮溶液 称取茚三酮1g置于盛有35mL热水的烧杯中使 其溶解，加入40mg氯化亚锡，搅拌过滤作为防腐剂。滤液放置于棕色 瓶中冷暗处过夜，加水至58.04 磷酸盐缓冲溶液 准确称取磷酸二氢钾4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入500mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 准确称取磷酸氢二钠11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入 500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀备用； 取上述配制好的磷酸二氢钾溶液10mL与190mL磷酸氢二钠溶液混匀即为 pH8.04磷酸盐缓冲溶液。
食品分析第十一章_蛋白质和氨基酸的测定
福林酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法 约小2个数量级。
五、考马斯亮蓝染料比色法
原理：
考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与 蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在 620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。
此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和 小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。
六、染料结合法
m
式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL； V1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； c—盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L； M—N的摩尔质量，14.01g/mol；
m—样品的质量或体积，g； F—氮换算为蛋白质的系数。 一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、 高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71； 肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、 向日葵为5.30。
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的样品．如含赖氨酸、 组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适 当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液 呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧ 蒸馏装置不能漏气。
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 （也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然 后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的 氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非 蛋白氮多的要单测）。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。
合物的最大吸收波长为560nm。
五、考马斯亮蓝染料比色法
原理：
考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与 蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在 620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。
此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和 小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。
六、染料结合法
m
式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL； V1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL； c—盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L； M—N的摩尔质量，14.01g/mol；
m—样品的质量或体积，g； F—氮换算为蛋白质的系数。 一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、 高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71； 肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、 向日葵为5.30。
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的样品．如含赖氨酸、 组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适 当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液 呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧ 蒸馏装置不能漏气。
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 （也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然 后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的 氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非 蛋白氮多的要单测）。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。
合物的最大吸收波长为560nm。
蛋白质及氨基酸的测定
当脲被小心加热至150-160℃时，可由两个分子间 脱去一个氨分子而生成双缩脲反应方程式如下：
双缩脲在碱性条件下与少量硫酸铜溶液作用生成 紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应
1.标准曲线的绘制
以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质 样按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、 110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管 中，然后各加上1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至 50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心后的 透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器 零点并测定各溶液的吸光度值A。以蛋白质的含量为横坐标，吸 光度值A为纵坐标绘制标准曲线 2.样品的测定 准确称取适量样品（即使得蛋白质含量在40-110mg之间） 于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在 相同条件下测其吸光度值A。用测得的A值在标准曲线上即可查 得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。
2.催化剂
• 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
3.氧化剂
• 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。 • 常用的有：高氯酸，过氧化氢
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
414202146原理由于氨基酸为两性结构向aa的溶液中加入甲醛溶液十七碱性消失这时可以用标准强碱溶液滴定后计算出aa试剂40中性甲醛溶液用百里酚酞作指示剂用naoh将40甲醛中和至淡蓝色01百里酚酞乙醇溶液01mollnaoh标准溶液414202147测定1吸取待测液50ml于250ml锥形瓶中01百里酚酞指示剂23滴2用01mollnaoh标准溶液滴定到淡蓝色再加40中性甲醛溶液20ml3摇匀静止1min继续用01mollnaoh标准溶液滴定至淡蓝色记录第二次滴定所消耗的naoh溶液的体积v
蛋白质和氨基酸的测定
24
三、半微量凯氏定氮法
25
三、半微量凯氏定氮法
26
27
计算
X
(V1
V2 ) m
c 10
0.014
F
100%
V
X: 样品中蛋白质的含量，%； V1: 样品消耗盐酸标准液的体积，ml； V2 : 试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml； V: 样品定容总体积，mL; c: 盐酸标准溶液的浓度，mol/L； m: 样品的质量(体积)，g(ml)； F: 蛋白质换算系数; 0.014: mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
❖ 这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程中 带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、 多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者 药品级的添加剂。
通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。
四 蛋白质的快速的测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏 度高、准确，不要大仪器，但费时间，有 害气体污染环境，影响操作人员健康。
收后再用标准盐酸溶液滴定，根据标准酸消耗 量求出含氮量,乘以蛋白质转换系数即为食物中 粗蛋白质含量。
7
整个过程分四步：消化、蒸馏、吸收、滴定
① 消化
将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中 的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2 +12SO2 +16H2O
❖ 目前农业部规定的检测方法， 主要是检查牛奶中是否含有皮革 水解蛋白，这是动物胶原蛋白中 的特有成分，在乳酪蛋白中则没 有，所以一旦验出，则可认为含 有皮革水解蛋白。
三、半微量凯氏定氮法
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三、半微量凯氏定氮法
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计算
X
(V1
V2 ) m
c 10
0.014
F
100%
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X: 样品中蛋白质的含量，%； V1: 样品消耗盐酸标准液的体积，ml； V2 : 试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml； V: 样品定容总体积，mL; c: 盐酸标准溶液的浓度，mol/L； m: 样品的质量(体积)，g(ml)； F: 蛋白质换算系数; 0.014: mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
❖ 这种方法水解出来的蛋白质，由于加工过程中 带入了重金属铬，原材料本身带来的诸如二噁英、 多氯联苯等毒害物质，使其不可能作为食品或者 药品级的添加剂。
通过单独的重金属检测确定是否添加不合格水解蛋白。
四 蛋白质的快速的测定法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏 度高、准确，不要大仪器，但费时间，有 害气体污染环境，影响操作人员健康。
收后再用标准盐酸溶液滴定，根据标准酸消耗 量求出含氮量,乘以蛋白质转换系数即为食物中 粗蛋白质含量。
7
整个过程分四步：消化、蒸馏、吸收、滴定
① 消化
将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中 的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2 +12SO2 +16H2O
❖ 目前农业部规定的检测方法， 主要是检查牛奶中是否含有皮革 水解蛋白，这是动物胶原蛋白中 的特有成分，在乳酪蛋白中则没 有，所以一旦验出，则可认为含 有皮革水解蛋白。
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• 3、吸收：硼酸溶液吸收氨后，颜色由淡红色逐渐变成蓝绿色， 收集吸收瓶中馏出液体积约250mL左右
• 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热。
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16
• 三、滴定
3.氧化剂
• 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。
• 常用的有：高氯酸，过氧化氢
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11
仪器
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
特点：瓶颈长、耐高温
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12
装、 置常
量 凯 氏 定 氮
B
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2
蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、 氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还 含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮 则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。
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3
测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。
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试剂
• 1、浓硫酸 • 2、硫酸铜 • 3、硫酸钾 • 4、4%硼酸溶液 • 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙
醇溶液均匀混合 • 6、40%NaOH溶液 • 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液
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测定
一、消化：
• 1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量 多少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL
定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
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A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
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6
常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法
半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法
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7
常量凯氏定氮法
• 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。
• 一 原理：
• 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨， 再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将 氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴
• 纯硫酸的沸点是340 °C附近，因其温度达不到最适， 则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫 酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水 分不断逸出使硫酸浓度增大。
• 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的
铵盐分解释放出氨而造成编辑损ppt失。
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2.催化剂
• 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
• 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其
倾斜放置于放有石棉网的电炉上。
• 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。
间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量
直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。
测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋 白质含量测定。
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4
蛋白质的测定方法：
凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法
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5
凯氏定氮法
• 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。
• 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。
• 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物， 因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。
• 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
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• 二、蒸馏
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼 酸溶液及指示剂2~3滴）
• 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液，并 摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再 从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约30min
蛋白质及氨基酸的测定
生物技术第三组
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1
蛋白质存在于一切生物的原生质中，是 构成生物体细胞组织的重要成分，是生命的 物质基础。凡是有生命的物体，无论是动植 物还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营 养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准液 直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐 酸溶液用量，同时作一试剂空白，记录空白试验 消耗盐酸标准液的体积。
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结果计算：
C.吸收
ห้องสมุดไป่ตู้
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液
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9
• 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。
1.增温剂
• 当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮 化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 °C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。
• 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热。
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• 三、滴定
3.氧化剂
• 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。
• 常用的有：高氯酸，过氧化氢
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仪器
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
特点：瓶颈长、耐高温
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装、 置常
量 凯 氏 定 氮
B
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蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、 氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还 含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮 则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。
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测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。
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试剂
• 1、浓硫酸 • 2、硫酸铜 • 3、硫酸钾 • 4、4%硼酸溶液 • 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙
醇溶液均匀混合 • 6、40%NaOH溶液 • 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液
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测定
一、消化：
• 1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量 多少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL
定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
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A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
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常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法
半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法
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常量凯氏定氮法
• 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。
• 一 原理：
• 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨， 再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将 氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴
• 纯硫酸的沸点是340 °C附近，因其温度达不到最适， 则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫 酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水 分不断逸出使硫酸浓度增大。
• 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的
铵盐分解释放出氨而造成编辑损ppt失。
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2.催化剂
• 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
• 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其
倾斜放置于放有石棉网的电炉上。
• 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。
间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量
直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。
测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋 白质含量测定。
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蛋白质的测定方法：
凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法
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凯氏定氮法
• 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。
• 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。
• 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物， 因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。
• 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
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• 二、蒸馏
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼 酸溶液及指示剂2~3滴）
• 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液，并 摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再 从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约30min
蛋白质及氨基酸的测定
生物技术第三组
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蛋白质存在于一切生物的原生质中，是 构成生物体细胞组织的重要成分，是生命的 物质基础。凡是有生命的物体，无论是动植 物还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营 养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准液 直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐 酸溶液用量，同时作一试剂空白，记录空白试验 消耗盐酸标准液的体积。
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结果计算：
C.吸收
ห้องสมุดไป่ตู้
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液
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• 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。
1.增温剂
• 当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮 化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 °C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。