9 蛋白质及氨基酸的测定

5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为
标准样绘标准曲线。
三．紫外吸收法
1．原理：利用蛋白质的特有基团，
R │ （— NH—CH—CO） 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白 质浓度成直线关系，求含量。
2．适用范围：常用于生物化学工作，因为 干扰因素多，故在食品分析领域应用不广 泛。
硫酸铜的作用
① 催化剂 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2 ↑ C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑ 此反应不断进行，待有机物被消化完后， 不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清 澈的蓝绿色。
② 可以指示消化终点的到达
⑦蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，
先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附 着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸 收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源， 否则吸收液将发生倒吸。
⑧硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸
收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。
⑨混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液
9 蛋白质及氨基酸的测定
概述
蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主
要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质 中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包 括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水 化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色 素）。
0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；
F—蛋白质系数；
m—样品质量，g。
改 进 后 的 水 化 装 置
硫酸钾的作用
加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物 的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应 温度其反应式如下：
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸 钾后，可使温度提高到400℃以上，原因主要在于 随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出 而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度 过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损 失： （NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如 玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为 5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦 粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。
蛋白质含量测定最常用的方法
•
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的
蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋
常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧 化钛。
常量凯氏定氮法 (1) 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和 水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结 合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼 酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据 标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
4. 结果计算
氨基酸态氮（%） (V2 V1) c 0.014 100 m
式中 c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L; V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液 的体积，mL; V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶 液的体积，mL; m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014——氮的毫摩尔质量，g/m mol
2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮
量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食 品中游离氨基酸的测定）
3. 操作方法：同时取两份样：
① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中 和样液中其它酸性物质。
② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。
二者之差可计算氨基酸含量。
④硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜
也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量 不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需 再增加氢氧化钠用量。
⑤若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试
样5ml的比例增加硫酸用量。
⑥消化时间一般约4小时左右即可，消0 分钟即可.
中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
蛋白质的分光光度测定法
1、原理 样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使
蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸 铵。然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中， 铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二 乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物。 在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比 较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含 量。
3．主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min）
4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线
氨基酸态氮的测定
(一）双指示剂甲醛滴定法：
1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再 用强碱来滴定 —COOH 基。并用间接的方 法测定氨基酸的总量。反应式如下：
在接受瓶中加入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷 凝管下端插入液面以下。
③ 滴定
取下接收瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
④ 结果计算W
(V1
V0) c m
0.014
V2
100
F
100
式中W—蛋白质的含量，g/100g；
V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L；
是个经典分析方法，至今仍 被作为标准检验方法。
•
此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。
凯氏定氮法：常量法、微量法及经改 进后的改良凯氏定氮法
微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少， 且有一套微量凯氏定氮器。
目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、 微量凯氏定氮法。
在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中 氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题， 即分解试样所用的催化剂。
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要 化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有 微 量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别 其他有机化合物的主要标志。
（3）蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同， 故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋 白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份 蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。
微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 滴定用盐酸浓度由0.05 mol/L→ 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。
① 样品消化 将消化完全的消化液冷却后，完全转入
100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。
② 蒸馏
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至 2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
③ 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
（5） 注意事项
①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加指
示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。
②若样品含脂肪或糖较多时，应注意发
生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。
③若样品消化液不易澄清透明，可加入
300g/L2~3mL过氧化氢后再加热。
白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了
核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白
质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单
的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食
品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，
①消化
消化反应方程式如下：
2NH2(CH2)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还 原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
北京福德泰和科技有限公司 产品名称： 凯氏定氮仪
蛋白质测定仪
双缩脲法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度 高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境 污染。 新开发的：双缩脲法、
紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。
③ 吸收与滴定
加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收， 待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微 弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的 变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应 方程式如下：
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
3. 说明及注意事项： ① 加入甲醛以后应立即滴定，不宜放置 时间过长，以免甲醛聚合，影响测定结 果。 ② 样品中若含有铵盐，由于胺离子也能 与甲醛反应，将使测定结果偏高：
4NH4++6HCHO→(CH2)6N4+6H2O+4H+