仪器分析第四章 高效液相色谱
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《仪器分析》高效液相色谱法
《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支，是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作为仪器分析中的一种常用方法，具有快速、高效、灵敏度高等特点，在许多领域得到广泛应用。
高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法，其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离，再通过检测器对各个化合物进行定量测定。
高效液相色谱法相比传统的液相色谱法，具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点，从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。
高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析，例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。
以药物分析为例，在药物研发和质量控制中，高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标，从而保证药品的质量和安全性。
而在环境分析方面，高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物，为环境保护提供科学依据。
此外，高效液相色谱法还可以用于食品安全监测，检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质，保障人民群众的身体健康。
高效液相色谱法的操作相对简单，但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。
首先，需要选择合适的色谱柱和填充剂。
不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂，以获得最佳的分离效果和分辨率。
其次，需要合理选择流动相的组成和流速。
流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果，因此需要经过调试和优化。
最后，还需要进行准确的定量分析。
在高效液相色谱法中，常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等，可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。
综上所述，高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法，具有广泛的应用领域和潜力。
在实际应用中，需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂，合理选择流动相的组成和流速，并进行准确的定量分析。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量 因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆 满的选择性分离。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
仪器分析-高效液相色谱法
提高检测灵敏度。
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
仪器分析高效液相色谱PPT课件
这种固载化的配基将只能和具有 亲和力特性吸附的生物大分子相互 作用而被保留，没有这种作用的分 子不被保留。
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6.1.6 离子交换色谱法
离子交换色谱法
固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，
在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基
阳离子交换树脂
在表面未端芳环上接上季胺基
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离
的一种色谱方法。 ➢ 以凝胶 (gel) 为固定相，它类似于分子筛， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多。
➢ 凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量 的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等 体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
荧光检测器——10-11g。
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6.1.6 离子交换色谱法
离子交换色谱法
固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，
在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基
阳离子交换树脂
在表面未端芳环上接上季胺基
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离
的一种色谱方法。 ➢ 以凝胶 (gel) 为固定相，它类似于分子筛， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多。
➢ 凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量 的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等 体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
荧光检测器——10-11g。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱法—认识高效液相色谱法(仪器分析课件)
二、高效液相色谱法的基本原理
基本原理：
混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相 和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的 不同，随流动相在两相间进行反复多次分配过程，经过 一定长度的色谱柱，彼此分离开来，最后按一定顺序流 出。
三、高效液相色交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种 离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同 孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
2.分配色谱（液-液分配色谱）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合 固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。
三、高效液相色谱法的主要分离类型
一、高效液相色谱法的基本概念
二、高效液相色谱法的基本原理
三、高效液相色谱法的主要分离类型 四、HPLC与GC的比较
一、高效液相色谱法的基本概念
基本概念：在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵 敏度的在线检测器，是一种新型分离分析技术。
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。
四、HPLC与GC的比较
1）应用范围不同 液相色谱非常适合分子量较大、难气化等物质的分离分析。
2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 ① 可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离 的选择性。 ② 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大。 ③ 液相色谱通常在室温下操作。
高效液相色谱法—高效液相色谱法的应用(仪器分析课件)
二、流动相的制备
• 新型的高效液相色谱仪多用专用的在线真空 脱气技术。真空脱气装置串联到储液系统中， 并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵 前的连续真空脱气。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱仪使用操作技 能
02 掌握高效液相色谱仪各部分操作技能 相关标题文字
高效液相色谱法实验技术
学生分组练习
根据实验室的实际情况，安排学生分组练习， 一部分学生练习配制流动相，一部分学生练习 操作仪器(以苯试样为例）。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱法的应用技
术
02 掌握流动相配制及制备技术
项目三 高效液相色谱法应用
03
——流动相的配制
·流动相的配制 ·流动相的脱气方法
复习： 高效液相色谱仪是以液体为流动相，高压泵将贮 液瓶中流动相经过进样器送入到色谱柱，然后从 废液口中流出；样品经进样器注入后，流动相将 样品带入到色谱柱进行分离，分离后的组分依次 先后顺序进入检测器。记录仪将检测器的信号记 录下来，得到液相色谱图。
➢2.取混合均匀的溶液， 经0.45µm的有机膜过滤， 再脱气15分钟即可
二、流动相的制备
➢3.将过滤好的流动相装入到流动相的储液瓶中， 然后进行脱气
二、流动相的制备
• 4.脱气方法：
• 常用的方法有吹氦脱 气法、加热回流法、 抽真空脱气法、超声 脱气法。以上几种方 法是离线脱气法，在 流动相存放过程中又 会有空气重新溶解在 储液系统中，
高效液相色谱法实验技术 操作过程演示3
观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排 放，关闭排放阀。
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综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、 灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术 的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科 学领域获得广泛的应用。
4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种
溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定
相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小
的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或 洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的 保留行为。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
1. 液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动 相组成。
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检 测器——10-11g。
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液 分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色 谱等类型。
2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速 度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次 分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传 质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
分离柱
压力计
ห้องสมุดไป่ตู้
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
4. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压 泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将 两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再 输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按 一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量， 在高压下混合。
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
二、HPLC仪器
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图所示。
He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载 体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种
溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定
相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小
的差异进行分离。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或 洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的 保留行为。
第四章 高效液相色谱
1. 概述 2. HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
3. 流动相和固定相简介 4. 高效液相色谱方法各论
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
1. 液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动 相组成。
的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过 程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀， 流量精度和重复性为0.5%左右。
输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检 测器——10-11g。
3. HPLC与GC的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性 等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相 色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动 相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条 件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下 几方面：
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液 分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色 谱等类型。
2. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速 度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次 分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传 质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物 质的分离。
3. HPLC与GC的比较
c. 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于 色谱分离条件的选择。
d. 柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中， 柱外区域扩张可以忽略不计。
e. 使用成本：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测 器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互 相补充的。
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次， 因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻 尼器)。
马达
密封
往复式拉动
到色谱柱 脉动阻 尼器
球阀
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
4）梯度洗脱：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子 强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
分离柱
压力计
ห้องสมุดไป่ตู้
反压调节
注样阀
过滤器
1. 高压输液系统
1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 m，可防 止颗粒物进行泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
3）高压泵： 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中
a. 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、 热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。
b. 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对 组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改 进分离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作 为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、
分 子
药品、多糖、高聚物、农药、 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换