高通量测序原理
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3’ 5’
Cycle 1: 加入反应体系 掺入一个碱基 移除其他未掺入的核苷酸
A T G C G C A G A T G C T T A C G A T A C C C G A
信号检测 Cycle 2-n: 加入反应体系，循环cycle 1
C T
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的保护基团
应用
• • • • • 测序与重测序 表达谱分析 Small RNA鉴定与定量 SNP检测 DNA甲基化分析
Illumina Solexa 合成测序 基本原理
李珊珊 21620101152311
Solexa技术介绍
• Solexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家 创立，利用专利核心技术“DNA 簇” 和 “可逆性末端终结”，达成自动化样本制 备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Solexa 的基本原理
扩增
单链引物
“桥”结 构
DNA簇
单分子克隆
将DNA片段通过adapter锚定在芯片上
准备DNA片段
两端接上 adapters
循环扩增DNA片段成“DNA簇”
Sequence ~1000 DNA片段per ~ 1 µm “DNA簇” ~1000 “DNA簇” per 100 µ square m ~40 million clusters per experiment
20 microns
检测
可逆终止反应 Reversible Terminator Chemistry
• 4种标记过的核苷酸
O HN O PPP 3’ O N
荧光基团
O 5’ DNA O HN O O N
X
保护基团
百度文库
掺入 检测 去保护基团 去荧光基团
3’ OH
游离3‘末端
Next cycle
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
优缺点
• 高度自动化的系统 • 读取片段多，适合进行大量小片段的测序， 如microRNA profiling
• 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降 低，信号衰减，读取序列较短，给从头测 序（de novo sequencing） 拼接带来困难
技术特色突出表现
• 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独 运行一个样品，也可以把多个样品混合在 一起检测； • 一次实验可读取大于15 亿个碱基/芯片； • 无需建库，自动化样品制备，简单； • 实验费用低，测序成本为传统测序方法的 1/100； • 样本使用效率极高，所以对少量样本也可 以极灵敏精确地检测。
2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行 下一轮测序反应
T C
G A T
5’
通过荧光信号分析核苷酸序列 TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
7
8
9
TTTTTTTGT…
根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列， 转换成相应的DNA序列
Cycle 1: 加入反应体系 掺入一个碱基 移除其他未掺入的核苷酸
A T G C G C A G A T G C T T A C G A T A C C C G A
信号检测 Cycle 2-n: 加入反应体系，循环cycle 1
C T
1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可 以被去除的保护基团
应用
• • • • • 测序与重测序 表达谱分析 Small RNA鉴定与定量 SNP检测 DNA甲基化分析
Illumina Solexa 合成测序 基本原理
李珊珊 21620101152311
Solexa技术介绍
• Solexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家 创立，利用专利核心技术“DNA 簇” 和 “可逆性末端终结”，达成自动化样本制 备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Solexa 的基本原理
扩增
单链引物
“桥”结 构
DNA簇
单分子克隆
将DNA片段通过adapter锚定在芯片上
准备DNA片段
两端接上 adapters
循环扩增DNA片段成“DNA簇”
Sequence ~1000 DNA片段per ~ 1 µm “DNA簇” ~1000 “DNA簇” per 100 µ square m ~40 million clusters per experiment
20 microns
检测
可逆终止反应 Reversible Terminator Chemistry
• 4种标记过的核苷酸
O HN O PPP 3’ O N
荧光基团
O 5’ DNA O HN O O N
X
保护基团
百度文库
掺入 检测 去保护基团 去荧光基团
3’ OH
游离3‘末端
Next cycle
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
优缺点
• 高度自动化的系统 • 读取片段多，适合进行大量小片段的测序， 如microRNA profiling
• 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降 低，信号衰减，读取序列较短，给从头测 序（de novo sequencing） 拼接带来困难
技术特色突出表现
• 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独 运行一个样品，也可以把多个样品混合在 一起检测； • 一次实验可读取大于15 亿个碱基/芯片； • 无需建库，自动化样品制备，简单； • 实验费用低，测序成本为传统测序方法的 1/100； • 样本使用效率极高，所以对少量样本也可 以极灵敏精确地检测。
2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团和荧光基团，进行 下一轮测序反应
T C
G A T
5’
通过荧光信号分析核苷酸序列 TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
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TTTTTTTGT…
根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列， 转换成相应的DNA序列