64-0015 肝素钠抗FIIa效价检测EP方法与USP方法对比验证方案0000

G：美国标准品质量g；
365：美国标准品浓度USP U/ml。
6.4.1.3.用滴管加入质量为W的新鲜放冷的注射用水到50ml比色管中，盖紧瓶塞轻摇混合，待全部溶解混匀后，按1ml/支的装量，分装于2ml的洁净安瓿中，火焰封口；放入冰箱内2~8℃下保存3个月，使用时放至室温。
6.4.1.4.配制/分装记录填写附件3。
8.00
7.65
总体积（ml）
10.00
10.00
10.00
6.5.2.1.7.样品检测
取12支试管，标记为S1、S2、S3、S1、S2、S3、T1、T2、T3、T1、T2、T3每个浓度做2平行管。做将试管置于冰水浴中，用100-1000ul可调式微量移液器分别加入绵羊血浆1.0ml和相应浓度的标准品溶液、样品溶液1.0ml，混匀，避免产生气泡。将试管按S1、S2、S3、T1、T2、T3的顺序放入恒温水浴箱中，37℃下恒温水浴15分钟；向每支试管中加入1.0ml脑磷脂溶液，37℃下恒温水浴2分钟两分钟后，加入3.7g/L (w/v)氯化钙溶液1.0ml，混匀后以秒计时，记录绵羊血浆凝固所用时间。
质量控制部
刘家全
会审批准签名表
姓名
部门/职务
签名
日期
许万玲
质量控制部
生测Ⅰ组检验员
钱欣
质量保证部经理
李坦
质量总监
注：参加会审的人员：
1.海普瑞公司验证委员会的成员；
2.与该验证方案相关部门的主管（班组长）以上成员。
1.
1.1.对肝素钠抗FⅡa效价检测一般有两种方法：
1.1.1.按照《美国药典》（现行版）中“肝素钠专论”提供的方法，以USP的标准品为基准标准品，其检测结果的单位用USP U/mg表示；
凝固终点判断：将试管拿起，液面停止颤动不流动为凝固终点，并记录凝
固时间。空白实验在样品检测前后各做一次，且两次的凝固时间不应相差太大。
6.5.2.1.3.标准品高、中、低三个浓度梯度的制备
取出10IU/ml标准品溶液，放至恢复室温。取3支试管，标记为S1、S2、S3，按表2加入相应体积的溶液，混匀，即得到高、中、低三个浓度梯度的标准溶液。
1.1.2.按照《欧洲药典》（第Ⅳ版）中“肝素钠专论”提供的方法，以WHO的标准品为基准标准品，其检测结果的单位用IU/mg表示；
本公司目前采用的是第一种方法，即《美国药典》（现行版）的方法。
1.2.美国方法所得结果如果换算成国际单位的结果，通常采用将结果乘以0.93计算；为了确认该换算系数的正确性，我们采用两种方法对同一批样品检测，并对其结果作换算比较。
4.1.2.负责审核验证结果；
4.1.3.负责组织验证中的偏差调查。
4.2.质量控制部：
4.2.1.负责起草验证方案；
4.2.2.在执行方案时提供检测数据；
4.2.3.负责提供相关的记录、数据、操作程序和相关资料；
4.2.4.负责完成验证报告；
4.2.5.配合进行验证结果准确性的调查。
5.
5.8.附件8：R-64-0015-08《肝素钠抗FⅡa效价检测结果计算原始记录（EP）》
6.
6.1.总则
6.1.1.验证过程严格按照本方案规定的内容和项目进行，所有相关信息记录在附件设定的表格中。表格如果不够可以复印。
6.1.2.任何与本方案不一致的地方应充分调查与记录。只有不一致的数据被证明不会影响本方案的执行才可以被认可接受；质量保证部门决定例外数据是否可以接受。
6.1.3.报告中所有的记录都要有记录人（操作人）、记录日期（操作日期）、审核人（复核人）、审核日期（复核日期）。
6.5.1.2.取10ml试管若干支，分别加入同一浓度、不同体积8.0USP U/ml的标准品和样品溶液B，相邻两管中的体积以5%的级差递减，最大体积为0.8ml，然后用生理盐水将各管最终体积补足到0.8ml，再分别向各管中加入绵羊血浆1.0ml、0.1%氯化钙溶液0.2ml，立即混匀，置于37℃恒温水浴孵育60分钟。
1.3.本文为确认换算系数的正确性提供了可执行的程序。
2.
本方法适用于肝素钠抗FⅡa效价检测结果的对比以及计算换算系数。
3.
3.1.《美国药典》（现行版）P905肝素钠专论
3.2.《欧洲药典》（EPⅣ）
3.3.SOP 51-0011《电热恒温水箱使用标准操作规程》
3.4.SOP 51-1002《一般溶液配制标准操作规程》
6.5.2.1.8.重新制备标准品及样品的高、中、低三个浓度梯度，按T1、T2、T3、
S1、S2、S3的顺序进行样品检测，记录绵羊血浆凝固所用时间。
6.5.2.2.重复5.2.1.单次独立实验操作三次，三次的工作标准品和供试品必须重新
制备，绵羊血浆是新的一瓶。
6.5.2.3.结果计算
6.5.2.3.1.单次独立实验的结果分析
单次独立实验样品log效价即M计算：
斜率：b= HL（LS+LT）/（Inh）
样品溶液效价的log值：M =（PT－PS）/db
式中：I——相邻两剂量比率的In值。
误差
（hd－1）（n－1）
SSres= SStot－SStreat－SSblock
总
ndh－1
SStot=∑（y－ ）2
计算均方差，即各方差和与相应自由度的比值。
计算F-ratio值，即各均方差与残留误差（S2）的比值。
查EP（第四版）5.3.生物测定和试验结果统计分析中的表8.1，评估实验的有效性。
其中：2031：1支WHO V标准品含有肝素钠的活性单位。
加入质量为W水的新鲜放冷的注射用水到标准品安瓿瓶中，充分溶解后混匀。
6.4.2.3.取100ml容量瓶，放入电子天平中称重并去皮，用一次性胶头滴管吸取浓度为1000IU/ml标准品，准确称取1.00g在100ml容量瓶中，加入100.00g注射用水，加塞轻摇混匀后，按1ml/支的装量，分装于2ml的安瓿中，封口，并记录实际分装数量，放入冰箱内2～8℃下保存3个月，使用时放至室温。
6.4.1.1.取一支批号为K-5的美国标准品，将标准品安瓿用砂轮沿颈部切割一圈，用酒精棉球擦颈部，待酒精挥发后，掰断安瓿颈部，用一次性胶头滴管吸取安瓿瓶内所有标准品，加入50ml比色管中，称重并去皮。
6.4.1.2.需加注射用水质量的计算：
W=（G×365÷8）－G，
式中：W：需加注射用水质量g；
6.5.1.3.孵育结束后，取出试管，观察各管凝结程度，根据各管凝结程度与其相对应的肝素钠体积的对数值，代入相应的公式中计算样品效价。具体操作见SOP 54-0010《肝素钠抗FIIa效价检测标准操作规程》。
6.5.2.EP方法：
6.5.2.1.单次独立实验
6.5.2.1.1.绵羊血浆的制备
取出绵羊血浆，放入恒温水浴箱中，温度为小于37℃，待绵羊血浆完全融化后，用垫上脱脂棉的漏斗过滤到250ml三角瓶中，将过滤好的绵羊血浆放入冰箱冷藏室，2~8℃保存，待用。
6.2.验证使用的试剂及溶液
6.2.1.方案中使用的试剂是分析纯的氯化钠，分析纯的氯化钙，验证用水为本公司自产。
6.2.2.方案中使用的绵羊血浆已经通过预实验检测，其血浆不凝固的最小标准品浓度应在1~3 USP U/ml之间。
6.2.3.记录试剂名称、规格、数量、生产或分装商以及试剂批号等内容，检查结果记录在附件1中。
6.5.2.1.2.空白实验：
取一支10ml具塞试管，置于冰水浴中，用100-1000ul可调式微量移液器加入绵羊血浆和9g/L（w/v）氯化钠溶液各1.0ml，混匀，但避免产生气泡，将试管放入恒温水浴箱中，37℃下恒温水浴15分钟；用100-1000ul可调式微量移液器加入1.0ml脑磷脂溶液，两分钟后加入3.7g/L (w/v)氯化钙溶液1.0ml，混匀后以秒计时，记录绵羊血浆凝固所用时间。
6.4.2.4.配制记录填写在附录4中
6.5.待验证的方法
P方法
6.5.1.1.精密称取样品的范围在30-50mg，用0.9%氯化钠溶液将样品溶解并配制成1.0mg/ml的样品溶液A；吸取0.5ml样品溶液根据估计效再用0.9%氯化钠溶液稀释成8.0USP U/ml样品溶液B，根据预实验将8.0USP U/ml的样品溶液B和USP标准品继续稀释至使绵羊血浆不凝固的最小浓度。
6.3.3.检查结果记录在附件2。
6.3.4.可接受标准
6.3.4.1.在验证中使用的恒温水浴箱的温度，必须经过校验，并在有效期内。
6.3.4.2.在验证中使用的所有天平、分度吸管、可调式微量移液器等必须经过校验，并在有效期内。
6.4.标准品的配制
6.4.1.8.0 USP U/ml USP标准品的配制
样品：LT=1× ﹢2× ﹢3× －0.5×（d+1）PT
式中：d——标准品/样品剂量的个数。
变异分析：
计算：HP=n/d HL=12n/（d3－d）
K=n（PS+PT）2/（hd）
式中：n——每个剂量重复的次数
h——标准品、样品的个数
方差分析：
变异来源
自由度
方差和
试品间
h－1
SSprep= HP（PS2+PT2）－K
表2
试管编号
加入试剂名称及体积
S1
S2
S3
10IU/ml标准品溶液（ml）
1.70
2.00
2.35
9g/L（w/v）氯化钠溶液（ml）
8.30
8.00
7.65
总体积（ml）
10.00
10.00
10.00
标准溶液的浓度（IU/ ml）
1.70
2.00
2.35
6.5.2.1.4.1.0mg/ml样品溶液的制备
计算标准品、样品每个浓度平行管㏒凝固时间的均值记为 、 、 、 、 、 。
计算两次温育顺序不同的标准品、样品每个浓度㏒凝固时间均值的平均