肝素钠效价检测方法
肝素钠含量检测操作规程
肝素钠含量检验操作规程1范围1.1适用于肝素钠生产车间过程控制中各控制点肝素钠含量的检测。
2定义2.1肝素钠化验指对肝素效价的检测过程。
3参考《美国药典》4职责4.1相应职责由车间化验员承担。
5操作程序5.1仪器、用具与试剂5.1.1恒温水浴锅5.1.2试管架5.1.310ml具塞试管5.1.4100ul或250ul微量进样器5.1.510ml刻度吸管5.1.62ml刻度吸管5.1.71ml可调式加液器5.1.820ml带塞样瓶5.1.90.9%氯化钠溶液5.1.100.25%氯化钙溶液5.1.11经过标定的绵羊血浆5.1.128.0u/ml肝素钠标准溶液5.1.13计时器5.2操作步骤5.2.1取样5.2.1.1根据车间生产实际，一般酶解液、洗涤液、沉淀废液取样量为8±2ml，吸附废液为20±2ml。
特殊情况可适当多取，取样要做到均匀有代表性。
5.2.2样品检测5.2.2.1根据实际情况将试管摆放在试管架上。
5.2.2.2用100ul微量进样器取8.0u/ml肝素标准溶液，加标准品之前，用标准液冲洗进样器两次，根据标定的血浆灵敏度n，分别按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入一排5支10ml具塞试管中，作为标准溶液的浓度梯度。
5.2.2.3.1酶解液、洗涤液、沉淀废液进样：用同一个进样器取供试液，取之前先用供试液将进样器冲洗三次，然后再按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入另一排5支10ml具塞试管中，作为供试液浓度梯度。
5.2.2.3.2吸附废液进样：用2ml刻度吸管取供试液，取之前先用供试液将刻度吸管冲洗三次，然后再按600ul、800ul、1000ul、1200ul、1400ul进样量加入另一排5支10ml具塞试管中，作为供试液浓度梯度。
加样时要非常精确，不能有气泡产生；这一步是本试验的关键步骤。
64-0015 肝素钠抗FIIa效价检测EP方法与USP方法对比验证方案0000
365：美国标准品浓度USP U/ml。
6.4.1.3.用滴管加入质量为W的新鲜放冷的注射用水到50ml比色管中，盖紧瓶塞轻摇混合，待全部溶解混匀后，按1ml/支的装量，分装于2ml的洁净安瓿中，火焰封口；放入冰箱内2~8℃下保存3个月，使用时放至室温。
6.4.1.4.配制/分装记录填写附件3。
8.00
7.65
总体积（ml）
10.00
10.00
10.00
6.5.2.1.7.样品检测
取12支试管，标记为S1、S2、S3、S1、S2、S3、T1、T2、T3、T1、T2、T3每个浓度做2平行管。做将试管置于冰水浴中，用100-1000ul可调式微量移液器分别加入绵羊血浆1.0ml和相应浓度的标准品溶液、样品溶液1.0ml，混匀，避免产生气泡。将试管按S1、S2、S3、T1、T2、T3的顺序放入恒温水浴箱中，37℃下恒温水浴15分钟；向每支试管中加入1.0ml脑磷脂溶液，37℃下恒温水浴2分钟两分钟后，加入3.7g/L (w/v)氯化钙溶液1.0ml，混匀后以秒计时，记录绵羊血浆凝固所用时间。
质量控制部
刘家全
会审批准签名表
姓名
部门/职务
签名
日期
许万玲
质量控制部
生测Ⅰ组检验员
钱欣
质量保证部经理
李坦
质量总监
注：参加会审的人员：
1.海普瑞公司验证委员会的成员；
2.与该验证方案相关部门的主管（班组长）以上成员。
1.
1.1.对肝素钠抗FⅡa效价检测一般有两种方法：
1.1.1.按照《美国药典》（现行版）中“肝素钠专论”提供的方法，以USP的标准品为基准标准品，其检测结果的单位用USP U/mg表示；
64-0019 肝素钠粗品原料抗FIIa效价取样方法验证报告0000
文件使用类型该报告制定参与人：该报告存放到以下部门办公室：会审批准签名表注：参加会审的人员：1. 海普瑞公司验证委员会的成员；2. 与该验证方案相关部门的主管（班组长）以上成员。
目录1. 目的 (4)2. 范围 (4)3. 参考 (4)4. 验证内容 (4)5. 结论 (9)1. 目的1.1. 海普瑞公司质量控制部对各办事处交来的肝素钠粗品原料进行抗FIIa效价复测时，样品的取样方法有两种：一种是从办事处取过的样品袋中直接抽取。
一种是按照办事处的取样方法重新取样。
1.2. 为了确认两种取样方法得到的样品，其检测结果不存在显著性差异，我们用同一种检测方法对两种取样方法得到的样品进行检测，并对检测结果进行比较确认。
1.3. 本文件为两种取样方法结果的比较确认提供了可执行的程序。
2. 范围被验证的方法适用于肝素钠粗品原料抗FIIa效价复测样品的取样过程。
3. 参考《美国药典》（27版P905）SOP 20-1005《肝素钠粗品取样标准操作规程》SOP 20-1010《肝素钠粗品复检取样标准操作规程》SOP 51-0011《电热恒温水箱使用标准操作规程》SOP 51-1002《一般溶液配制标准操作规程》SOP 54-0010《肝素钠抗FIIa效价检测预实验标准操作规程》SOP 54-0011《肝素钠抗FIIa效价检测标准操作规程》SOP 60-0002《公司验证制度》4. 验证内容待验证的取样方法从六个办事处各取10批粗品原料，对每一批样品采用以下两种方法取样直接从每批原料的原包装袋中抽取原样：颗粒状颗粒状或块状粗品的取样方式：每批粗品的取样区域分为该包装袋的正反两面，根据粗品重量，每面从包装开口处至袋尾设2~3条取样平行线，每条平行线上取样点不少于2个，每批重量在1 kg以下的粗品，正反两面从包装开口处至袋尾各取两条平行线，每条平行线取两个点，共取八个取样点，用长柄取样勺分别从八个取样点取出粗品至粉碎机中，要做到每勺份量大致一样。
肝素钠的检测方法
肝素钠的检测方法德晟肝素钠检测方法如下：一．效价F：（标准≥150IU/mg），环境温度要求20~30℃。
F=标品微升数*预估效价/样品微升数1.1试剂：1羊血浆（冷冻保存，使用时室温解冻，过滤）28IU/mg肝素钠标准品30.9%生理羊水：9g氯化钠（精确至0.01g）溶解于100ml去离子水中，并定容至1000ml，待用。
40.25%氯化钙溶液：用0.9%生理盐水配制，取1.25gCaCl2（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至500ml，待用。
58%柠檬酸钠溶液：用0.9%生理盐水配制，取20g柠檬酸钠（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至250ml，待用。
1.2测定8%柠檬酸钠溶液用量：取3支试管分1、2、3，分别加入标准品溶液110ul，再依次加入8%柠檬酸钠溶液10ul、20ul、30ul，→分别加入0.25%氯化钙溶液0.8ml，加入过滤好的羊血浆1ml，摇匀，置于37℃水浴中10min，观察凝固情况，取半凝固管的柠檬酸钠量xul作为后续的加量标准。
2.1待测品配制：M=20/样品预估效价（g）称取Mg待测样品（精确至0.0001g），溶解于生理盐水中，并定容至100ml，取溶液2ml溶液溶解定容至50ml，取5ml样品溶液于试管中剩余样液冷藏保存。
2.2测定：标准管：取10支试管分别加标品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。
待测管：取10支试管分别加样品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。
二．PH值精确称取0.4g样品（精确至0.01g）溶于40ml去离子水中，测定其PH值，记录室温，湿度。
肝素钠测定数据以及标准曲线
肝素钠的提取与检测摘要本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。
对国内外肝素钠的提取和纯化方法进行研究和分析，建立以牛内脏（肝、肺、心）为原料，采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。
利用天青A染色法检测肝素钠的效价，测定波长是505nm，与标准曲线对比可得到样品中肝素钠的效价。
利用浓硫酸氧化法，在波长为298nm处的吸光度来确定肝素钠的浓度。
利用双缩脲法，在波长为540nm处的吸光度来确定蛋白质的含量。
试验测得肝素钠的效价平均值为139.483U/mg，肝素钠的浓度平均值为200.8752mg/kg，去除蛋白质效果良好，均在99%以上。
关键词：肝素钠，盐解，树脂，天青A，纯化，蛋白质1.1研究背景和意义1.1.1研究背景肝素钠又称肝素，是重要的生物药品，作为天然的抗凝血物质而受到世界各国的重视。
我国是世界上肝素钠主要出口国之一，但是出口产品以低效价的粗品肝素为主。
肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。
肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在[1]。
这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种活性逐渐表现出来。
肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。
中国具有丰富的畜产品副产物资源，但我国生产的肝素产品效价低，提取率低的问题很突出，这种情况下，只有提出肝素提取纯化新工艺，才能提高畜产品加工副产物的附加值，拓宽利用领域，增加国民收入，提高中国在国际上的地位。
1.1.2研究意义肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。
目前，国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，在提取工艺中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、肝素蛋白质复合物的分解和粗品肝素的精制三个过程。
国内每年猪牛屠宰量极大，副产物产量极高，但是目前利用率却很低。
1 肝素钠及其制剂效价测定方法的改进
（ ｉ ｇｕＩｓｔ ｅ ｏ ｒｇＣ ｎｒ ，Ｎ ｎ １０ ８ ｈｎ ） Ｊ ｎ ｓ ｔｕ ｆｒ ｕ ｏｔ ｌ ａ ｇ２ ０ ０ ，Ｃ ｉ ａ ｎ ｉｔ Ｄ ｏ ａ
Ａｂｓｒ ｃ ： ｒ ｏ ｅ ｔ ａ ｔ Ｐｕ ｐ ｓ Ｔｏ ｄ ｖ ｌｐ ａｍｅｈ ｄ ｆｒｔ ｅｐ ｔｎ ｙ ｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆｈ ｐ ｒｎ ｓ ｄ ｕ ｗｉ ｈ ｅ ｌ ｓ ｅ ｅｏ ｔ ｏ ｏ ｈ ｏｅ ｃ ｅｅ ｍｉａｉｎ ｏ ｅ ａｉ ｏ ｉ ｍ ｔ ｓ ｅ ｐ ｐ ａ — ｈ
３ ２ 羊血浆 法和 兔全 血 法测定 结果 的 比较 ． 肝 素 钠 （ 号 ：５ ２ ９ 用 羊 血 浆 法 和 兔 全 血 法 批 ０１１）
多次测 定 效价 ， 进行 比较 ， 果见表 １ 结 。经 检 验 ， Ｐ
＞ ０ ， 明两 种方 法结 果无 显著 性差 异 。 ０．５ 表
３ １ 精 密 度 试 验 ．
取 ３批 供 试 品 溶 液 （ 号 ： ５２９ ０ １２ ， 批 ０ １ １， ５ ２０ ０ １２ ）各 测定 ５次 ， 果 分别 为 １７６ １３９ １６９ ５２１， 结 ７ ． ，７ ． ，７ ． ｕ ｍ ， Ｓ 分 别 为 ０ ６ ％ ， ．４ ， ．７ ， 小 于 ／ Ｌ ＲＤ ．９ ０ ４ ％ ０ ２ ％ 均
对 ３ 个厂 家的 ９ 肝 素钠原 料 、 批 ６批 注射 液用 兔 全血法与羊血 浆法作 比对 试验 ， 结果见表 ２ 和表 ３ 。
表 ２ 两 种 效 价 测 定 方 法 测 定 ９ 肝 素 钠 的 结 果 比较 批
因素 多 ， 此 重现性 较 差 。国 内曾有 采用 绵羊 血浆 、 因
原料 （ 号 ：５ ２ ９ ０ １２ ，５ ２ １ ， 批 ０ １ １ ，５２ ０ ０ １２ ） 山东 东 营天 东 生物 化 学 制 药 有 限公 司； 素钠 注射 液 （ 号 ： 肝 批
肝素钠软膏剂的制备与抗IIa因子效价测定
肝素钠软膏剂的制备与抗IIa因子效价测定摘要：目的：制备肝素钠软膏剂并建立制剂质量控制方法。
方法：根据基质处方，采用后加乳化剂并搅拌的方法制备软膏剂基质，将药液加入基质中搅拌均匀即可制得软膏剂。
用生色底物法分别测定原料药和制剂中肝素钠的抗IIa因子的效价。
结果：所制得的软膏剂外观与性状符合制剂要求，软膏剂中肝素钠含量为311.15IU/g，为标示量的97.23%。
结论：本文肝素钠软膏剂的制备方法可行，质量控制方法客观准确，适合实验室与医院药房少量制备肝素钠外用剂型。
关键词：肝素钠软膏剂生色底物法抗IIa因子效价肝素钠系从猪或牛的肠粘膜提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质，具有延长凝血时间的作用。
研究表明，肝素钠除了具有抗凝活性之外，还具有抗炎、抗过敏和抗补体等药理活性[1]。
软膏剂是外用法给药的剂型之一，通过皮肤、孔窍、经络及病变局部等部位治疗疾病，避免了胃肠道的破坏与肝首过效应，减少血药浓度峰谷变化，已成为克服药物副作用的有效用药途径之一。
2005年版中国药典用兔血浆法，美国药典USP30版用羊血浆法测肝素钠效价的生物测定法。
中国药典2020版、美国药典USP37版收载了生色底物法测定肝素钠的效价。
血浆法由于不同批号的血浆所得实验结果有可能不同，因此肝素的效价测定也应采用抗IIa因子的发色底物的分光光度法。
本文拟制备肝素钠软膏剂，并用生色底物法测定原料药和制剂中的肝素钠抗IIa因子效价，以对制剂进行质量控制。
1 试剂与仪器UV2550/UV2700 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；肝素钠原料药系本实验室自制，抗IIa因子效价标示的肝素钠标准品购自惠兴生化试剂有限公司（9.5mg，2144IU）。
抗凝血酶ATⅢ(Chromogenix，10IU/瓶)，发色底物S-2238(Chromogenix, 25mg)，Ⅱa因子(中国食品药品检定研究院，840IU/瓶)，三羟甲基氨基甲烷与聚乙二醇6000 ( 国药集团化学试剂有限公司)。
肝素钠及其制剂效价测定方法的改进
5
6
7
8
9
10
x ±s
羊血浆法 176 178 177 179 177 178 177 177 178 178 177. 7 ±0. 7
兔全血法 175 178 177 177 177 180 178 176 177 176 177. 2 ±1. 4
对 3 个厂家的 9 批肝素钠原料、6 批注射液用兔
全血法与羊血浆法作比对试验 ,结果见表 2 和表 3。
表 2 两种效价测定方法测定 9 批肝素钠的结果比较 Tab 2 Results of potency determination for nine batches of heparin
sodium by different methods
批号
取冷冻贮藏的绵羊血浆 ,置于不超过 37 ℃的水 浴融化 ,以脱脂棉过滤至清洁干燥的玻瓶中备用 。 取血浆 1 mL 置试管内 ,加入 0. 25 %氯化钙溶液 0. 8 mL ,混匀 ,在 (37 ±1) ℃水浴中保温 ,若在 5 min 内凝 结 ,则血浆可用于实验 。 2. 2 标准品溶液的制备
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中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2008 年第 29 卷第 5 期
凝结程度 ,按式 (1) 计算 。
> 0. 05 ,表明两种方法结果无显著性差异 。
表 1 同一批样品 10 次测定的结果比较
Tab 1 Results of potency determination for heparin sodium by different methods
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肝素钠效价检测方法
试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。
4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。
估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8
估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。
4.2.2.3检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待
用。
取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加
入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组
加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液
20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。
并将每只试管盖好管盖，
倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检
查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。
凝固程度标准：
①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。
②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。
③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。
④1∕4凝固：少量溶液凝固。
⑤0凝固：溶液悟凝固现象。
若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为
V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1)
(S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。
)
待检样品效价计算公式：
4.2.2.4F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数4.2.2.5
注意事项：
4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。
4.2.2.6.2在使用新开启羊血浆前，需检测羊血浆是否能够正常使用。
取试管一只，加入0.8ml 0.25%CaCl2及过滤后的羊血浆1ml ，盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域5min，5min后检查血浆是否凝固，如血浆凝固则可使用，未凝固则不能使用。
4.2.2.6.3 如在检测过程中，标样的1∕2凝固点高于200ul，则需重新调整羊血浆的1∕2凝固点。
方法如下：取3组各10只试管
组一： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
组二： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
组三： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
将每只试管盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检查各管的凝固程度，并记录确定标样的1∕2凝固点及体积。
如1∕2凝固点在110ul —200ul的，即可使用。
选值最好在130ul—170ul范围内。
8%柠檬酸钠需用生理盐水配置。
4.2.2 效价（羊血浆法）
4.2.2.1、试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。
4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。
估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8
估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。
4.2.2.3 检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待用。
取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。
并将每只试管盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。
4.2.2.4 凝固程度标准：
①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。
②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。
③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。
④1∕4凝固：少量溶液凝固。
⑤0凝固：溶液悟凝固现象。
若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为
V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1)
(S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。
)
4.2.2.5 待检样品效价计算公式：
F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数
4.2.2.6 注意事项：
4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。
4.2.2.6.2在使用新开启羊血浆前，需检测羊血浆是否能够正常使用。
取试管一只，加入0.8ml 0.25%CaCl2及过滤后的羊血浆1ml ，盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域5min，5min后检查血浆是否凝固，如血浆凝固则可使用，未凝固则不能使用。
4.2.2.6.3 如在检测过程中，标样的1∕2凝固点高于200ul，则需重新调整羊血浆的1∕2凝固点。
方法如下：取3组各10只试管
组一： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
组二： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
组三： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul
8%柠檬酸钠 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 ul
0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml
羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
将每只试管盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检查各管的凝固程度，并记录确定标样的1∕2凝固点及体积。
如1∕2凝固点在110ul —200ul的，即可使用。
选值最好在130ul—170ul范围内。
8%柠檬酸钠需用生理盐水配置。