肝素钠测定数据以及标准曲线

肝素钠的提取与检测摘要本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。

对国内外肝素钠的提取和纯化方法进行研究和分析，建立以牛内脏（肝、肺、心）为原料，采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。

利用天青A染色法检测肝素钠的效价，测定波长是505nm，与标准曲线对比可得到样品中肝素钠的效价。

利用浓硫酸氧化法，在波长为298nm处的吸光度来确定肝素钠的浓度。

利用双缩脲法，在波长为540nm处的吸光度来确定蛋白质的含量。

试验测得肝素钠的效价平均值为139.483U/mg，肝素钠的浓度平均值为200.8752mg/kg，去除蛋白质效果良好，均在99%以上。

关键词：肝素钠，盐解，树脂，天青A，纯化，蛋白质1.1研究背景和意义1.1.1研究背景肝素钠又称肝素，是重要的生物药品，作为天然的抗凝血物质而受到世界各国的重视。

我国是世界上肝素钠主要出口国之一，但是出口产品以低效价的粗品肝素为主。

肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。

肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在[1]。

这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种活性逐渐表现出来。

肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。

中国具有丰富的畜产品副产物资源，但我国生产的肝素产品效价低，提取率低的问题很突出，这种情况下，只有提出肝素提取纯化新工艺，才能提高畜产品加工副产物的附加值，拓宽利用领域，增加国民收入，提高中国在国际上的地位。

1.1.2研究意义肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。

目前，国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，在提取工艺中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、肝素蛋白质复合物的分解和粗品肝素的精制三个过程。

国内每年猪牛屠宰量极大，副产物产量极高，但是目前利用率却很低。

其主要原因是加工技术和装备水平落后，产品提纯方面的产业化技术还没有真正突破。

1.1.3肝素效价显色原理肝素是一种粘多糖，在多糖链上带有很多阴离子基团，如磺酸基、羧基等。

因而肝素具有很强的负电性，能与阳离子或带正电荷的分子结合，生成复合物。

天青A染料是一种碱性染料，即正电荷部分能与肝素的阴离子结合，生成肝素天青复合物，并能表现因光异色现象，即产生一种较原来染料颜色不同的反应，这一反应程度与肝素结合量有一定关系。

1976年，杰奎斯等在贝克曼DK-2分光光度计上利用天青A作肝素定量测定，发现低浓度肝素在波长505nm，pH=8.6的条件下，肝素浓度与吸光值之间符合朗白---比尔定律。

该法可用于测定肝素效价和生产过程的控制。

2实验材料与方法2.1实验材料2.1.1试剂和材料牛内脏秦宝肝素标准品中国药物生物检定所（北京）氯化钠上海恒远生物科技有限公司乙醇（95%）分析纯天津市凯通化学试剂有限公司巴比妥分析纯西安化学试剂厂天青A染料生物染色剂天津市天新精细化工开发中心氢氧化钠分析纯天津市大茂化学试剂厂硫酸分析纯白银化学试剂厂硼砂分析纯上海易利生物科技有限公司陶氏AMBERLITE TM FPA98CL食品级特种聚合物（树脂）上海唯高实业有限公司2.1.2实验设备JJ—2B组织捣碎匀浆机金坛市医疗仪器厂PH-3C计上海佑科仪器仪表有限公司85-2恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司电热恒温热水槽HH-S8型北京科伟永兴仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂100目筛浙江上虞市水仙纱筛厂电磁炉广东美的生活用品制造厂真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司真空抽滤机郑州长城科工贸有限公司756P紫外—可见分光光度计上海光谱仪器有限公司电子天平慈溪市天东衡器厂填充柱2.2实验方法原料——提取——吸附——洗涤——洗脱——沉淀——脱水干燥——肝素钠粗品——提纯——肝素钠。

2.2.1具体操作控制(1)提取[2,3]取牛肺样品100g，加入5倍量的蒸馏水，在组织捣碎机中充分破碎至肉糜状，用NaOH溶液调ph至8.5，加入5%NaCL在60℃下不时搅拌2h，立即升温至100℃10min沉淀蛋白质，用100目的筛过滤，滤液备用。

(2)吸附滤液冷却至50℃左右，用氢氧化钠调节ph至8.5，加入8%的已处理好的树脂，在恒温磁力搅拌器上维持温度在50℃左右，连续吸附8h，过滤，树脂备用。

(3)洗涤将树脂装入填充柱，先用蒸馏水冲至无色，虑干。

用 1.2mol/L的氯化钠浸泡洗涤30min。

滤液弃掉。

(4)洗脱在树脂填充柱中加入5mol/L的NaCL浸泡3h，再用3.5mol/L的NaCL浸泡2h，将两次的滤液收集在一起备用。

(5)沉淀蛋白质将滤液调pH至3.5处理30min，沉淀酸蛋白，过滤；将滤液调pH至10，处理3h沉淀碱蛋白，过滤。

(6)乙醇沉淀取滤液用1.5倍95%酒精处理2h，真空抽滤，保留固体，滤液收集进行乙醇回收。

(7)干燥把抽滤固体在60℃下真空干燥。

得到肝素粗品。

2.2.2肝素效价检测采用天青A染色法检测肝素效价[4,5]，即先用肝素标准品作光密度标准曲线，然后测定样品的光密度值，对照标准曲线查出样品的效价。

具体的检测方法如下：将1.0 gNaOH 用蒸馏水定容于50 mL 容量瓶中，即得到0.5 mol/L 的NaOH 溶液。

称取巴比妥5.52 g，溶于上述NaOH 溶液中，待完全溶解后，冷却，用蒸馏水稀释至500 mL，用pH 计校正。

称取天青0.5 g，先用少量蒸馏水将其完全溶解，再稀释至500 mL，过滤，将滤液（储存液）冰箱保存。

临用时，吸取储存液5mL，加蒸馏水25 mL，混合均匀即得。

精确称取10～15 mg 的待测样品，先用蒸馏水溶解成1 mg/mL，再取250 mL容量瓶2个，各吸取上述溶液2.5 mL。

加水稀释至刻度，即配成0.01 mg/mL 的测定液。

吸取测定液1～5 mL 加蒸馏水补足到5 mL，充分摇匀后在505 nm 下测定吸光值，测3 个平行样，取其平均值[6]。

2.2.3肝素浓度的测定采用浓硫酸氧化法来检测溶液中肝素的含量，使用猪小肠肝素标准品来制作标准曲线，准确称取肝素标准品，配成482μg/mL肝素水溶液，再按0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL的浓度梯度，分别吸取不同体积的肝素水溶液，用蒸馏水定容到1mL，向每份溶液中分别加入3mL含0. 025M硼砂的90 %（v/v）的硫酸溶液，充分摇匀，置于90℃水浴中，经常搅动，10min后取出，冷至室温，半小时后采用紫外-可见分光光度计测定298nm光密度（另做不加肝素，以水代之的空白试验作对照），重复3次（n=3），取平均值。

按照各组试验数据可绘制出标准曲线，根据标准曲线方程计算溶液中的肝素含量[7]。

2.2.4蛋白质的测定蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。

在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。

因此可用比色法测定蛋白质浓度。

3结果分析3.1标准曲线的绘制3.1.1肝素效价标准曲线的绘制用肝素标准品绘制肝素效价标准曲线，其测定方法和检测结果如表 3.1 所示。

根据检测结果绘制出的肝素效价标准曲线如图 3.1 所示。

表3.1 肝素效价标准曲线测定数据Table 3.1 Dctection data of heparin potency standard curve试管号0 1 2 3 4 5肝素标准溶液（ml）0 1 2 3 4 5 蒸馏水（ml） 5 4 3 2 1 0巴比妥缓冲液（ml） 1 1 1 1 1 1天青A染料（ml） 1 1 1 1 1 1 OD505(nm) 0 0.056 0.104 0148 0.230 0.248肝素效价（U/mg）0 1.003 2.006 3.01 4.01 5.017图3.1 肝素效价标准曲线Fig.3.1 Standard curve of heparin potency以肝素效价为横坐标X，肝素在505nm 的吸光度为纵坐标Y，根据测定结果绘制标准工作曲线，试验结果表明其线性回归方程为：Y=0.0421X+0.001，回归方程的决定系数R2=0.9982，说明方程拟合较好。

3.1.2肝素浓度标准曲线用肝素标准品进行浓度测定，其测定数据结果如表 2.2 所示，根据测定数据做出肝素浓度标准曲线如图 2.2 所示。

表3.2 肝素浓度标准曲线测定数据Table 3.2 Data of heparin concentration standard curve肝素浓度(ug/ml) OD298(nm)14.46 0.10628.92 0.22357.84 0.48186.76 0.717115.68 0.930图3.2 肝素浓度标准曲线Fig.3.2 Standard curve of heparin concentration以肝素浓度为横坐标X，肝素在298 nm 的吸光度为纵坐标Y，根据测定结果绘制标准工作曲线，试验结果表明其线性回归方程为：Y=0.0039X+0.052，回归方程的决定系数R2=0.9994，说明方程拟合较好。

3.1.3蛋白质浓度标准曲线由血浆蛋白质标品得到蛋白质含量的标准曲线如图3.3所示。

图3.3 蛋白质含量标准曲线Fig.3.3 Standard curve of protein contents蛋白质含量的线性回归方程为：Y=0.0414X+0.0026，方程中Y 为吸光度，X 为测定液中蛋白质含量（mg/mL），线性回归方程的决定系数R2=0.9993。

说明标准曲线相关性好，可用该标准曲线计算肝素提取液中的蛋白质含量。

3.1.4牛内脏肝素钠效价测定牛内脏（肝脏、肺脏、心脏）肝素钠效价测定，其测定数据如表3.3所示。

肝脏肺脏心脏普通育肥牛27.91 197.15 169.83秦宝雪花牛33.05 254.16 154.39由表可知，各个部位肝素钠的含量差别巨大，表明肝素的含量与脏器的部位以及功能有一定的关系。

秦宝雪花牛的肝素的效价除心脏外均超过普通育肥牛。

宋大巍的肝素的高效提取和分离纯化技术研究中测得肝素粗品的效价为115U/mg，任红媛,何泼,李红心的猪小肠粘膜中肝素钠提取与精制工艺研究中以猪小肠为原料测得粗品肝素钠的效价为73.19U/mg。

周先琬[8]研究采用酶水解法精制肝素，其得到的粗肝素效价为50～120 U/mg。

差异源SS df MS F P-value F crit组间148.9871 1 148.9871 12.64067 0.001772 4.300949组内259.2992 22 11.78633由上表可知普通育肥牛和秦宝雪花牛肝素钠效价差异显著。