肝素钠的检测方法
肝素钠效价检测方法
肝素钠效价检测方法试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。
4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。
估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。
4.2.2.3检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待用。
取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。
并将每只试管盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。
凝固程度标准：①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。
②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。
③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。
④1∕4凝固：少量溶液凝固。
⑤0凝固：溶液悟凝固现象。
若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1)(S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。
)待检样品效价计算公式：4.2.2.4F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数4.2.2.5注意事项：4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。
肝素钠效价方法
肝素钠效价方法2. 1 羊血浆的制备取冷冻贮藏的绵羊血浆,置于不超过37 ℃的水浴融化,以脱脂棉过滤至清洁干燥的玻瓶中备用。
取血浆1 mL 置试管内,加入0. 25 %氯化钙溶液0. 8mL ,混匀,在(37 ±1) ℃水浴中保温,若在5 min 内凝结,则血浆可用于实验。
2. 2 标准品溶液的制备取肝素钠标准品(204 u/ mL) 适量,用煮沸放冷的纯化水稀释至100 u/ mL ,置4 ℃冷藏备用。
临用前用生理盐水精确稀释至7 u/ mL 。
2. 3 供试品溶液的制备称取肝素钠原料或量取肝素钠注射液适量,按估计效价用生理盐水稀释至与标准溶液相当的效价浓度。
2. 4 血浆半凝固度剂量(V1/ 2) 的测定取具塞试管3 支,分别于各试管中加入梯度剂量(170 ,200 ,230μL) 的标准溶液,再按顺序准确加入血浆1. 0 mL ,0. 25 %氯化钙溶液0. 8 mL ,立即加塞,倒置混合3 次,置(37 ±0. 5) ℃恒温水浴中保温,准确记录1 min ,判断每管凝结程度,结果判定V1/ 2在200μL 左右。
以此为中点,左右各以10μL 为一级,同法操作,测定V1/ 2为190μL 。
2. 5 肝素钠及其制剂的效价测定取具塞试管若干支,分别于各试管中加入梯度剂量的标准溶液和供试品溶液,以190μL 为中点,每隔10μL 为一级,同2. 3 项下方法操作,记录每管凝结程度,按式(1) 计算。
供试品的效价单位= V std ×C std ×VV sam ×W sam(1)式中:V std. 标准品1/ 2 凝固度的肝素加入体积(μL) ;C std. 标准品溶液的浓度(u/ mL) ; V sam. 供试品1/ 2 凝固度时的加入体积(μL) ;W sam. 供试品称取的重量(mg) ; V. 测定样品的总体积(mL)。
肝素钠实验报告
一、实验目的1. 学习肝素钠的提取方法。
2. 掌握肝素钠的鉴定方法。
3. 了解肝素钠的药理作用和应用。
二、实验原理肝素钠是一种具有抗凝血作用的物质，主要由猪肠黏膜或牛肺中提取。
其分子结构中含有大量的硫酸基团，具有强大的抗凝血活性。
本实验采用酸碱沉淀法提取肝素钠，并通过硫酸铜法进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 猪肠黏膜- 醋酸- 硫酸铜- 碘化钾- 氢氧化钠- 乙醇- 无水硫酸钠- 蒸馏水2. 实验仪器：- 研钵- 烧杯- 烧瓶- 漏斗- 滤纸- 酒精灯- 铁架台- 移液管- 容量瓶- 滴定管- 恒温水浴锅四、实验步骤1. 提取肝素钠（1）将猪肠黏膜剪成小块，放入研钵中，加入适量的醋酸，研磨至糊状。
（2）将糊状物倒入烧杯中，加入适量的蒸馏水，煮沸30分钟。
（3）用滤纸过滤，收集滤液。
（4）将滤液加入适量的氢氧化钠，调节pH值至7-8，静置过夜。
（5）次日，用滤纸过滤，收集沉淀。
（6）将沉淀用乙醇洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，得到肝素钠粗制品。
2. 鉴定肝素钠（1）取一定量的肝素钠粗制品，加入适量的硫酸铜溶液，观察颜色变化。
（2）取一定量的肝素钠粗制品，加入适量的碘化钾溶液，观察颜色变化。
五、实验结果与分析1. 提取结果经过提取，得到了肝素钠粗制品，颜色呈淡黄色。
2. 鉴定结果（1）加入硫酸铜溶液后，溶液呈蓝色，证明肝素钠中含有硫酸基团。
（2）加入碘化钾溶液后，溶液呈棕红色，进一步证明肝素钠中含有硫酸基团。
六、实验结论1. 成功提取了肝素钠粗制品。
2. 通过硫酸铜法和碘化钾法鉴定，证明肝素钠中含有硫酸基团。
七、实验讨论1. 在提取过程中，酸碱沉淀法能够有效提取肝素钠，但提取率较低。
2. 在鉴定过程中，硫酸铜法和碘化钾法能够快速、简便地鉴定肝素钠。
3. 肝素钠作为一种重要的抗凝血药物，在临床应用中具有重要意义。
八、实验总结本次实验通过学习肝素钠的提取与鉴定方法，掌握了肝素钠的基本知识。
在实验过程中，注意了操作细节，确保了实验结果的准确性。
肝素检验细则
肝素钠检验项目附细则一、效价测定操作步骤：1. 标准品制备：精密称量肝素钠标准品数量(mg)×197u/mg=总单位数×0.93=美国羊血浆法总单位数（uspu ）÷8 uspu/ml=需要实际加入的蒸馏水毫升数。
精确加入蒸馏水。
分装封口备用。
2. 效价测定：2.1 样品的制备：精确称量待测肝素粗品40~50mg 放入容量瓶中，再向其中加入1mg:1ml 比例的生理盐水，至样品全部溶解。
吸取0.5ml 上述溶液至西林瓶中，再按照公式：估效价÷16-0.5计算出生理盐水量，加入西林瓶中。
2.2 样品的测定：依据估计血浆标准凝固点±10ul 、±20ul 分别向试管中加入标准品和待测样品，再向各试管中加入1ml 血浆和0.8ml 的氯化钙生理盐水。
充分混匀后置37℃水浴锅中孵育1小时。
结果按照公式计算：实际效价=凝固点样品21V 凝固点21V 标准品 ×估效价 结果要求：所需主要仪器及价格：电子天平 单价：1000（物理）~2000（电子）rmb 水浴锅 单价：800rmb二、比旋度测定当平面偏振光通过含有某些光学活性物质（如具有不对称碳原子的化合物）的液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的振动平面向左或向右旋转。
偏振光旋转的度数称为旋光度。
旋光度有右旋、左旋之分，偏振光向右旋转（顺时针方向）称为“右旋”，用符号“+”表示；偏振光向左旋转（逆时针方向）称为“左旋”，用符号“-”表示。
偏振光透过长1dm ，且每1ml 中含有旋光性物质1g 的溶液，在一定波长与温度下，测得的旋光度称为比旋度。
比旋度是旋光物质的重要物理常数，可以用来区别药物或检查药物的纯杂程度，也可用来测定含量。
物质的旋光度不仅与其化学结构有关，而且还和测定时溶液的浓度、光路长度以及测定时的温度和偏振光的波长有关。
旋光度测定法的测定方法主要包括以下几个方面：1．仪器旋光计：《中国药典》规定，应使用读数至0.01。
肝素钠效价检测方法
肝素钠效价检测方法试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。
4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。
估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。
检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待用。
取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。
并将每只试管盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。
1h后取出各管，检查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。
凝固程度标准：①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。
②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。
③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。
④1∕4凝固：少量溶液凝固。
⑤0凝固：溶液悟凝固现象。
若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1)(S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。
)待检样品效价计算公式：F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数注意事项：4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。
64-0015 肝素钠抗FIIa效价检测EP方法与USP方法对比验证方案0000
365：美国标准品浓度USP U/ml。
6.4.1.3.用滴管加入质量为W的新鲜放冷的注射用水到50ml比色管中，盖紧瓶塞轻摇混合，待全部溶解混匀后，按1ml/支的装量，分装于2ml的洁净安瓿中，火焰封口；放入冰箱内2~8℃下保存3个月，使用时放至室温。
6.4.1.4.配制/分装记录填写附件3。
8.00
7.65
总体积（ml）
10.00
10.00
10.00
6.5.2.1.7.样品检测
取12支试管，标记为S1、S2、S3、S1、S2、S3、T1、T2、T3、T1、T2、T3每个浓度做2平行管。做将试管置于冰水浴中，用100-1000ul可调式微量移液器分别加入绵羊血浆1.0ml和相应浓度的标准品溶液、样品溶液1.0ml，混匀，避免产生气泡。将试管按S1、S2、S3、T1、T2、T3的顺序放入恒温水浴箱中，37℃下恒温水浴15分钟；向每支试管中加入1.0ml脑磷脂溶液，37℃下恒温水浴2分钟两分钟后，加入3.7g/L (w/v)氯化钙溶液1.0ml，混匀后以秒计时，记录绵羊血浆凝固所用时间。
质量控制部
刘家全
会审批准签名表
姓名
部门/职务
签名
日期
许万玲
质量控制部
生测Ⅰ组检验员
钱欣
质量保证部经理
李坦
质量总监
注：参加会审的人员：
1.海普瑞公司验证委员会的成员；
2.与该验证方案相关部门的主管（班组长）以上成员。
1.
1.1.对肝素钠抗FⅡa效价检测一般有两种方法：
1.1.1.按照《美国药典》（现行版）中“肝素钠专论”提供的方法，以USP的标准品为基准标准品，其检测结果的单位用USP U/mg表示；
肝素钠含量检测操作规程
肝素钠含量检测操作规程肝素钠含量检验操作规程1范围1.1适用于肝素钠生产车间过程控制中各控制点肝素钠含量的检测。
2定义2.1肝素钠化验指对肝素效价的检测过程。
3参考《美国药典》4职责4.1相应职责由车间化验员承担。
5操作程序5.1仪器、用具与试剂5.1.1恒温水浴锅5.1.2试管架5.1.310ml具塞试管5.1.4100ul或250ul微量进样器5.1.510ml刻度吸管5.1.62ml刻度吸管5.1.71ml可调式加液器5.1.820ml带塞样瓶5.1.90.9%氯化钠溶液5.1.100.25%氯化钙溶液5.1.11经过标定的绵羊血浆5.1.128.0u/ml肝素钠标准溶液5.1.13计时器5.2操作步骤5.2.1取样5.2.1.1根据车间生产实际，一般酶解液、洗涤液、沉淀废液取样量为8±2ml，吸附废液为20±2ml。
特殊情况可适当多取，取样要做到均匀有代表性。
5.2.2样品检测5.2.2.1根据实际情况将试管摆放在试管架上。
5.2.2.2用100ul微量进样器取8.0u/ml肝素标准溶液，加标准品之前，用标准液冲洗进样器两次，根据标定的血浆灵敏度n，分别按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入一排5支10ml具塞试管中，作为标准溶液的浓度梯度。
5.2.2.3.1酶解液、洗涤液、沉淀废液进样：用同一个进样器取供试液，取之前先用供试液将进样器冲洗三次，然后再按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入另一排5支10ml具塞试管中，作为供试液浓度梯度。
5.2.2.3.2吸附废液进样：用2ml刻度吸管取供试液，取之前先用供试液将刻度吸管冲洗三次，然后再按600ul、800ul、1000ul、1200ul、1400ul进样量加入另一排5支10ml具塞试管中，作为供试液浓度梯度。
加样时要非常精确，不能有气泡产生；这一步是本试验的关键步骤。
HPLC法测定肝素钠原料中EDTA―2Na的残留共5页文档
HPLC法测定肝素钠原料中EDTA―2Na的残留肝素钠是从猪小肠黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道尔顿，临床常作为注射剂使用。
肝素钠本身带负电荷，能干扰血凝过程的许多环节，其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。
具体涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。
肝素钠作为原料药，中国药典中明确规定了其重金属限度的检测，但由于其来源于动物组织提取，实际生产工艺中均要增加去除重金属的工艺。
目前多采用添加EDTA-2Na来螯合重金属，形成水溶物后，经分级沉淀步骤去除螯合物。
EDTA-2Na收载于FDA《非活性组分指南》，可用于非注射和注射给药制剂，会与人体内的钙离子形成螯合物，引起低血钙等症状。
由于肝素钠生产过程中使用EDTA-2Na去除重金属，所以在终产品中可能残留EDTA-2Na，对其进行检测有重要的意义。
1仪器与材料11仪器TG332A型分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；LC-15C 型高效液相色谱仪（日本岛津）；LC-20AD型紫外检测器（日本岛津）；1.2材料硫酸铜（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；EDTA-2Na （分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；肝素钠（注射级，批号：HM120401、HM120402、HM120403，石家庄市协和药业有限公司）。
水为自制纯化水（二级反渗透法）。
2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料WondaSilC18（200mm×46mm×5μm）；流动相：0025mol/l硫酸铜溶液（用稀硫酸调节pH至30）；检测波长：254nm；流速：10ml/min；检测温度：室温；进样量：20μl。
2.2溶液的制备2.2.1空白溶液的制备精密量取004mol/l硫酸铜溶液10ml，置50ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肝素钠的检测方法
德晟肝素钠检测方法如下：
一．效价F：（标准≥150IU/mg），环境温度要求20~30℃。
F=标品微升数*预估效价/样品微升数
1.1试剂：
1羊血浆（冷冻保存，使用时室温解冻，过滤）
28IU/mg肝素钠标准品
30.9%生理羊水：9g氯化钠（精确至0.01g）溶解于100ml去离子水中，并定容至1000ml，待用。
40.25%氯化钙溶液：用0.9%生理盐水配制，取1.25gCaCl2（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至500ml，待用。
58%柠檬酸钠溶液：用0.9%生理盐水配制，取20g柠檬酸钠（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至250ml，待用。
1.2测定8%柠檬酸钠溶液用量：
取3支试管分1、2、3，分别加入标准品溶液110ul，再依次加入8%柠檬酸钠溶液10ul、20ul、30ul，→分别加入0.25%氯化钙溶液0.8ml，加入过滤好的羊血浆1ml，摇匀，置于37℃水浴中10min，观察凝固情况，取半凝固管的柠檬酸钠量xul作为后续的加量标准。
2.1待测品配制：
M=20/样品预估效价（g）
称取Mg待测样品（精确至0.0001g），溶解于生理盐水中，并定容至100ml，取溶液2ml溶液溶解定容至50ml，取5ml样品溶液于试管中剩余样液冷藏保存。
2.2测定：
标准管：取10支试管分别加标品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。
待测管：取10支试管分别加样品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。
二．PH值
精确称取0.4g样品（精确至0.01g）溶于40ml去离子水中，测定其PH值，记录室温，湿度。
三．吸光度
精确称取0.2g样品(精确至0.01g)溶于50ml去离子水中，分别测定在260nm和280nm 的吸光度。
四．澄清度
称取1.00g样品溶于25ml去离子水中，测定640nm的吸光度。
五．比旋度
称取1.00g样品溶于25ml去离子水中，旋光仪测定其比旋度，取其三次均值。
注意：检测前所有试验仪器均用生理盐水清洗二至三遍。