去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达
赖氨酸特异性去甲基化酶1在肿瘤领域的研究进展
赖氨酸特异性去甲基化酶1在肿瘤领域的研究进展赖氨酸特异性去甲基化酶1在肿瘤领域的研究进展丁杰;张忠民;廖国庆;晏仲舒【期刊名称】《医学与哲学》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）是第⼀个被发现的赖氨酸特异性脱甲基酶，其可以特异地去除组蛋⽩H3第4位赖氨酸（H3K4）和组蛋⽩H3第9位赖氨酸（H3K9）的⼆甲基和⼀甲基修饰，调控靶基因的表达。
LSD1在肿瘤的发⽣、增殖、侵袭转移过程中均发挥了重要作⽤，有望成为肿瘤治疗的新的分⼦靶标。
本⽂就LSD1在肿瘤领域的研究进展作⼀综述。
%Lysine‐specific demethylase 1 (LSD1) ,the first discovered histone demethylase ,can specifically catalyze the demethylation of mono‐and dimethylated histone H3 lysine 4 (H3K4) and H3 lysine 9 (H3K9) ,and regulate the expression of its target genes .LSD1 play important roles in proliferation ,migration and invasion of various cancer cells , and it promises to be new molecular targets in cancer therapy .Thus ,the authors address the related issues along with research progress of LSD1 associated with carcinoma .【总页数】4页(57-60)【关键词】赖氨酸特异性去甲基化酶1;肿瘤;表观遗传【作者】丁杰;张忠民;廖国庆;晏仲舒【作者单位】贵州省⼈民医院胃肠外科贵州贵阳550002;贵州省⼈民医院胃肠外科贵州贵阳550002;中南⼤学湘雅医院胃肠外科湖南长沙410008;中南⼤。
sfat-1真核表达载体构建及其转基因细胞系建立的开题报告
sfat-1真核表达载体构建及其转基因细胞系建立的开题报告一、研究背景及意义：sfat-1是一种新发现的标志Sertoli细胞特异性表达的基因，在小鼠睾丸中高度表达。
Sertoli细胞是精子发生和分化的关键支持细胞，对精子形成的调节和分泌很重要。
sfat-1的表达与小鼠睾丸的正常发育和精子发生有关。
另外，sfat-1基因的编码蛋白中也含有肽酶水解位点，具有降解富含不饱和脂肪酸的能力。
因此，研究sfat-1的功能和表达机制，对于深入理解Sertoli细胞调控精子发生的生理机制，以及开发富含不饱和脂肪酸的新型食品等具有重要意义。
二、研究内容及方法：1. sfat-1基因克隆从小鼠睾丸中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到sfat-1基因的全长序列。
利用PCR技术将sfat-1基因克隆到真核表达载体中，并进行酶切验证。
2. 真核表达载体构建利用pcDNA3.1（+）作为载体，在其5'端和3'端分别加入CMV和BGH引物，构建出真核表达载体pcDNA3.1（+）-sfat-1。
3. 转基因细胞系建立将pcDNA3.1（+）-sfat-1转染到Sertoli细胞中，通过G418筛选得到稳定的转基因细胞系。
利用Western blot和Real-time PCR技术检测获得的细胞系中sfat-1基因的表达情况，并观察其对细胞功能的影响。
三、预期结果：成功构建pcDNA3.1（+）-sfat-1真核表达载体，并通过转基因细胞系建立得到稳定的sfat-1基因转染细胞系。
预计能够检测到sfat-1基因在转基因细胞系中的表达，并进一步探究sfat-1基因在Sertoli细胞中的功能和作用机制。
四、研究意义：本研究可深入探究sfat-1基因在Sertoli细胞中的功能和作用机制，为精子发生和分化的调节提供新的认识，并对开发富含不饱和脂肪酸的新型食品具有重要意义。
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇;朱鸿亮【期刊名称】《植物学研究》【年(卷),期】2015(004)002【摘要】本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染,探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响,建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。
结果表明,β-葡萄糖苷酶(GUS β-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。
农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效,结果准确可靠,从种子播种到收获蛋白只需25天左右。
该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。
【总页数】7页(P25-31)【作者】文莉薇;朱鸿亮【作者单位】[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京;;[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 [J], 常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉3.烟草基因组计划进展篇：6.烟草全基因组过量表达和RNA干涉体系的建立与应用 [J], 路铁刚4.棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 [J], 李妮娜;丁林云;张志远;郭旺珍5.杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶基因DsLYCE表达载体构建及其在烟草中瞬时表达分析 [J], 王计平; 安茜; 段露露; 赵熙宁; 岳敏; 崔红利; 李润植因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
AtICE1和AtCBF1～3基因表达载体的构建与转化烟草研究
AtICE1和AtCBF1～3基因表达载体的构建与转化烟草研究王冬梅;王明;李翠萍;苏承刚;张兴国;姚永宏【摘要】Cold-resistance in plants was determined by numerous genes. With transformation of the sole gene into plants, the Cold-resistance could be enhanced limitedly. Amplified from Arabidopsis thaliana genomic DNA and connected with Arabidopsis promoter 35 S, AtCBFl -3 and AtlCEl genes were used to construct the cold-induced plant expressing vectorpVCT2276. Thirty-five Kanamycin resistance plants were obtained by Agro-bacterium mediated genetic transformation. PCR results showed that 8 plants were positive. For later southern hybrid, 5 of positive plants were made strains.%植物抗寒属于复杂的数量性状.单一基因转化,植株抗寒性提高有限.本文利用拟南芥的AtCBF1～3和AtICE1 4个基因构建植物表达载体pVCT2276,通过农杆菌介导法转化烟草,获得35株抗性苗.经抗性筛选以及PCR鉴定,8株显示为阳性植株.将其中5株繁殖成株系,为后续的抗寒鉴定奠定基础.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2011(024)003【总页数】4页(P868-871)【关键词】抗寒；AtCBF1～3基因；AtICE1基因；转基因烟草【作者】王冬梅;王明;李翠萍;苏承刚;张兴国;姚永宏【作者单位】南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院，重庆，400715;重庆市农业科学院，重庆，401329【正文语种】中文【中图分类】Q78植物冷驯化机制一般有两种［1］:一种为冷诱导表达必须全部或部分借助ABA的低温诱导传递;另一种是纯粹的冷应答反应［1～2］，不依赖于ABA，表现为直接、快速的低温应答反应。
烟草化学诱导表达系统的建立
烟草化学诱导表达系统的建立代丽娟;郑唐春;刘彩霞;刘轶;由香玲;曲冠证【期刊名称】《植物研究》【年(卷),期】2016(36)6【摘要】化学诱导表达系统对植物功能基因的研究及植物基因工程应用有重要意义。
XVE是以雌激素为基础的用于诱导转基因植物中目的基因表达的一种系统,能够在可调控方式下诱导基因的表达。
目前,以烟草为遗传转化材料进行XVE系统研究的详细报道还未见发表。
本文以烟草作为研究对象,利用PCR技术从本实验保存的质粒pROKII-GFP中扩增出GFP基因。
构建雌激素诱导型植物表达载体(pER8-GFP)并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中;经潮霉素抗性筛选出转化植株后,用PCR鉴定出阳性转化植株,将阳性转化植株利用不同浓度和不同时间的雌激素进行处理,并结合定量PCR和Night SHADE植物活体成像系统对转基因植株的表达水平进行检测。
结果表明诱导p ER8-GFP载体在烟草中表达的最适雌激素浓度为25μmol·L^(-1),最适时间为48 h;同时在烟草胚轴与根尖细胞中检测到荧光信号,表明XVE化学诱导系统在烟草中也可以高效、严格的依赖雌激素的诱导来控制目的基因表达。
本研究将为烟草相关的化学诱导表达研究提供技术支持与解决方案。
【总页数】8页(P917-924)【关键词】雌激素诱导;基因表达;XVE;烟草【作者】代丽娟;郑唐春;刘彩霞;刘轶;由香玲;曲冠证【作者单位】东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室;东北林业大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.诱导烟草早花的PVX-FT系统的建立 [J], 高玉龙;肖炳光;Ralph E Dewey2.去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 [J], 常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉3.利用热诱导的位点专一性重组系统在烟草中控制基因表达 [J], 陈明;王立霞;彭向雷;徐惠君;林忠平4.PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究 [J], 刘洋;周鹏;庹德财;唐庆华;言普;黎小瑛;沈文涛5.病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草(Nicotiana bentha miana)rbcs 基因功能的研究 [J], 周晓馥;王兴智因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
AtICE1和AtCBF1~3基因表达载体的构建与转化烟草研究
Ｓｔ ｉｓｏ Ｖｅ ｔ ｒ Ｃｏ ｓｒ ｃｉ ｎ ａ ｄ Ｔｏ ｃ ｏ ｕｄ ｅ ｎ ｃ ｏ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｎ ｂａ ｃ
Ｔｒ ｎ ｆ ｒ ａ ｉｎ ｗｉ ａ ｏ ｍ ｔｏ ｔ Ａ娃ＣＥ ｎ ＣＢＦｌ一３ Ｃｌｓｅ ｎ ｓ ｓ ｈ １ ａ ｄ Ａｔ ｕ ｔｒ Ｇｅ ｅ
ＡｉＥ ｔ １和 Ｃ 几 ～ Ｃ ３基 因表 达 载 体 的 构 建 与 转 化 烟 草 研 究
王冬梅’王 明 ， ， 李翠萍 苏承刚 ， ， 张兴国ｈ， 永宏 姚
（． １南方 山地园艺学教育部重点实验室 ． 西南大学 园艺园林学 院， 重庆 ４ ０ １ ；． ０ ７ ５ ２ 重庆市农业科学院 ， 重庆 ４ １２ ） ０ ３ ９
ｃ ｕ ｄ ｂ ｎ ａ ｃ ｄ ｌ ｔｄ ｙ ｏ ｌ ｅ ｅ ｈ ｎ ｅ ｉ ｅ ｌ ．Ａｍｐ ｉ ｅ ｒ ｍ ａ ｉ ｏ ｓ ａ ｉ ｎ ｅ ｏ ｃ Ｄ ｍｉ ｌ ｄ ｆｏ Ａｒ ｂｄ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｇ ｎ ｍｉ ＮＡ ｎ ｏ ｎ ｃｅ ｔ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｐ ｍｏｅ ５ Ａ Ｃ ｉ ｆ ｓｈ ａ ａ ｄ ｃ ｎ ｅ ｔ ｄ ｗｉ Ａｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｒ ｈ ｏ ｔ ｒ Ｓ． ｚ ＢＦ１—３ ３ ａ ｄ ＡｔＣ ｅ ｅ ｒ ｓ ｄ ｔ ｏ ｓｒ ｃ ｈ ｏｄ— ｄ ｃ ｄ ｐ ａ ｔｅ ｐ ｅ ｓｎ ｅ ｔｒ ｐ ＇ ７ ． ｈｉ ｙ ｆ ｅ Ｋａ ａ ｅ ｎ ｒ ｓｓ ｎ ｅ ｐａ ｔ ｒ ｎ ｌ Ｅ１ ｇ ｎ ｓｗｅ ｅ ｕ ｅ ｏ ｃ ｎ ｔｕ ｔｔ ｅ ｃ ｌ ｉ ｕ ｅ ｌｎ ｘ ｒ ｓ ｉ ｇ ｖ ｃｏ ＶＣＩ ｎ ２２ ６ Ｔ ｒ ・ ｖ ｎ ｍｙ ｉ ｅ ｉｔ ｃ ｌ ｎｓ ｗｅ ｅ ｔｉ ａ
４ ０ １ Ｃ ｉａ２ Ｃ ｏｇ ｉ ｃｄ ｍ ｆ ｇｅｌ ｒｌ ｉ ｃｓ Ｃ ｏｇｉｇ４ １２ ， ｈｎ ） ０ ７６。 ｈ ；． ｈ ｎｑｎ ｎ ｇＡ ａｅ ｙｏ Ａ ｉｕｔ ａ Ｓ ｅ ｅ 。ｈｎｑｎ ０ ３ ９ Ｃ ｉ ｕ ｃ ｎ ａ
盐胁迫下盐穗木DNA甲基化程度与去甲基化酶基因(Ros1)表达的相关性研究
植 物的 固着 生活方 式 ， 不能像 动 物选 择 逃避 ， 不能
往往 相伴 着 表观 遗 传 多 态性 ， 表 明 盐 胁迫 影 响 苜
蓿甲基化的水平 Ｊ 。【 前人研究进展 】 Ｄ Ｎ Ａ 甲基
化（ Ｄ Ｎ Ａ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 在高等植物 中普遍存在 ， 主
文章 编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ３ ３ ０ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ５— ０ ８ ７ ８— ０ ８
０ 引 言
【 研究意义】 植物生长发 育过程 中直接会受
到干旱、 低温 、 盐 碱 及 辐 射 等 外 界 环 境 因素 的影 响， 这些逆境胁 迫不利于植物 的生长¨ 。 由 于
机制 。【 方法】 利用 ｑ Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 测定盐胁迫 下盐 穗木 幼苗同化枝和根基 因组 Ｄ Ｎ Ａ的甲基化程度 ， 探讨 Ｄ Ｎ Ａ的 甲基 化程 度与 去甲基化 酶基 因 Ｈ ｃ Ｒ ｏ ｓ ｌ 表达的相关性。 【 结果 】 在相 同 Ｎ ａ Ｃ １ 浓度胁迫 不 同时间下 盐穗木 同化
的负相关 ，盐胁迫能够提高 Ｈ ｃ Ｒ ｏ ｓ ｌ的表达 ， 降低基 因组 Ｄ Ｎ Ａ的 甲基化程度 ， 增强植物的耐盐性 。
关键词 ： 盐生植物 ； 基 因组 ； Ｎ ａ Ｃ Ｉ 处理 ； 甲基 化 和 去 甲基 化 ； 相 关 性
烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制
烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制烟草是管状花目茄科的一种重要的经济作物。
与其他植物相比,烟草具有较高的生物碱含量。
通常情况下,烟草中含量最高的生物碱是烟碱(Nicotine)。
烟碱可以使人的神经系统兴奋,具有提神醒脑镇静的作用,同时它也是栽培烟草的重要品质要素。
烟碱在烟碱去甲基化酶(Nicotine demethylase,NND)的催化下可以生成降烟碱(Nornicotine),降烟碱是烟草中的毒性成分,能够使实验动物致癌,同时也可对人体健康产生直接的负面影响。
烟草的生物碱组成中,降烟碱含量占烟碱与降烟碱总和的百分比称为烟碱转化率。
栽培烟草的烟碱转化率种内差异相对比较稳定,而种间差异很大,这种差异主要是由遗传基因不同而引起的。
栽培烟草中编码烟碱去甲基化酶的基因主要有CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10。
本文以栽培烟草白肋烟TN90、红花大金元及K326为实验材料,通过CRISPR/Cas9技术敲除烟碱去甲基化酶基因,以期获得低烟碱转化率的烟草低害素材。
本文的主要研究结果如下:(1)在栽培烟草白肋烟TN90、红花大金元及K326基因组中分别克隆了烟碱去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10的外显子1,并对其进行生物信息学分析。
测序及分析结果显示三种栽培烟草的烟碱去甲基化酶基因外显子1序列均为939bp,且不同烟草栽培品种的同一烟碱去甲基化酶基因序列完全一致。
生物信息学分析结果表明三个基因的外显子1均含有细胞色素P450酶高度保守区域以及底物识别结合相关区域。
(2)在烟碱去甲基化酶基因外显子1上设计敲除靶位点。
每个基因分别设计4个靶位点,三个基因共同的靶位点2个,共计14个敲除靶位点。
根据靶位点设计引物,分别构建了烟碱去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10敲除载体及三个基因共同的敲除载体。
通过农杆菌转化法将敲除载体分别转化栽培烟草白肋烟TN90、红花大金元及K326,通过抗性筛选获得T0代阳性转基因苗,并套袋自交收种子,播种到卡那抗性MS培养基上筛选获得T1代阳性转基因苗。
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去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉【摘要】植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子，参与基因的表达调控，与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。
以拟南芥AtROS1基因为目的基因，采用“酶切—连接”的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体pER8-ROS1。
将其转入农杆菌LBA4404菌株中，通过烟草瞬时表达技术，对该载体的诱导表达特性进行了研究。
qPCR结果表明：17-β-雌二醇处理能够有效调控pER8-ROS1中目的基因的表达，17-β-雌二醇最佳诱导浓度为50～100μmol· L－1；随着诱导时间的延长，目的基因表达量逐渐升高，在12 h 后达到最高。
该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。
%Plant demethylase ROS1 was an important factor in epigenetic regulation .It could activate the expression of genes and was closely related to the processes of plant development and various stress responses .In this study , At-ROS1 gene from Arabidopsis thaliana was used as the target gene , and ‘digestion-ligation'method was applied for constructing plant expression vector pER 8-ROS1 which could be induced by 17-β-estradiol.Then the vector was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 , and the inducible expression characteristics were verified by the transient expression system of Nicotiana tabacum.The results of qPCR showed that 17-β-estradiol could effectively induce the expression of the target gene in pER 8-ROS1 and the optimal concentration of 17-β-estradiol was 50 to 100μmol· L-1 .The expressionlevel of ROS1 gene gradually increased and reached the highest level at 12 h.The con-struction of pER8-ROS1 laid a good foundation for the epigenetic mechanism study in plant environmental stress .【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2016(028)005【总页数】7页(P717-723)【关键词】pER8-ROS1;17-β-雌二醇;化学诱导表达载体;瞬时表达【作者】常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091【正文语种】中文【中图分类】Q943.2DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是植物正常生长发育所必需的，也是植物逆境响应的重要机制。
DNA甲基化的水平主要靠DNA甲基化和去甲基化的作用调节，这2个过程相互平衡，维持了DNA甲基化模式的稳定。
植物基因组甲基化模式的形成主要依赖于主动去甲基化，因此主动去甲基化的研究逐渐成为甲基化研究领域的重点之一。
在植物中可能存在5种DNA主动去甲基化机制：DNA糖基化酶参与的碱基切除修复机制(base excision repair，BER)、脱氨基作用及G/T 碱基错配修复机制、核酸切除修复机制、氧化去甲基化机制及水解去甲基化[1]。
DNA去甲基化酶参与DNA主动去甲基化过程，并且占主导地位。
植物中的去甲基化转移酶主要有DME，ROS1，DML2和DML3 4个家族，它们均含有最保守的DNA糖基化酶结构域[2-4]。
其中，ROS1是植物体内第一个被克隆的去甲基化酶基因；植物通过ROS1家族介导的碱基切除修复(BER)机制实现DNA主动去甲基化[3]。
在BER途径中，ROS1双功能团酶切除甲基，使脱氧核糖和5-mC之间的核苷键断裂，产生DNA链上的AP(apurillic/apyrimidinic)位点，ZDP和APE1L将3′磷酸变成3′羟基，最后，由DNA聚合酶和DNA连接酶填补此缺口，最终C取代5-mC[5-6]。
ROS1是该通道中发挥作用的主要功能蛋白。
拟南芥ROS1功能缺失突变体研究表明，ROS1能够使目的基因启动子发生去甲基化，激活沉默基因的表达，从而调控植物生长发育及对环境胁迫的应答[3，7-10]。
另外，ROS1还可以阻止RNA介导的DNA甲基化[11-13]。
因此，研究ROS1的生物学功能对于丰富DNA主动去甲基化的机制，了解植物生长发育的调控机制，以及采用分子育种手段定向培育抗逆性强的树木新品种都具有重要价值。
化学诱导表达系统是研究基因功能的有效手段之一[14]。
其中，类固醇激活系统是基于糖皮质激素受体、雌激素受体等建立的较为精密的化学诱导表达系统，其主要是通过糖皮质激素受体、雌激素受体作为转录激活因子与融合启动子结合，来调控下游基因的表达。
当类固醇存在时，受体从细胞质的热休克蛋白90(HSP90)中解离出来，转移到细胞核中，并与融合启动子结合，激活目的基因的表达。
2000年，Zuo等[15]构建了雌激素激活表达系统(XVE系统)，该系统能够精密地调控下游基因的表达，并且对植物没有毒害作用，是研究基因功能的理想工具。
本研究以拟南芥去甲基化酶基因AtROS1为目的基因，构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的XVE系统载体pER8-ROS1，将其转入农杆菌LBA4404菌株中，通过烟草(Nicotiana tabacum L.)瞬时表达，对该载体的诱导表达特性进行了研究，为研究DNA去甲基化与植物生长发育以及抗逆胁迫之间的相互关系奠定了基础。
1.1 植物材料烟草由中国林业科学研究院林业研究所卢孟柱课题组馈赠。
播种于土壤中，并将其放入(26 ± 1)℃，16 h·d-1光照和50 μmol·m-2·s-1光强的人工气体培养箱中培养。
60 d后用于农杆菌介导的基因瞬时表达。
1.2 菌株、质粒及试剂含有雌二醇诱导型启动子的pER8-GFP质粒由Nam. Hai Chua博士(The Rockefeller University，USA)赠送，含拟南芥AtROS1基因cDNA的pET28a-ROS1质粒由Roldn-Arjona博士(Universidad de Córdoba，Spain)赠送。
农杆菌LBA4404为本实验室保存。
1.3 试验方法1.3.1 拟南芥ROS1基因诱导表达载体构建GenBank中AtROS1基因CDS区序列长度为4 182 bp，利用Primer 5.0设计特异性引物ROS1-F (5′-CCGCTCGAGATGGAGAAACAGAGGAGAGAAGA-3′)和ROS1-R (5′-CTAGACTAGTACGGATTAGGCGAGGTTAGC-3′)(下划线分别表示XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点)，以pET28a-ROS1质粒为模板，进行PCR扩增。
PCR 反应体系为20 μL，包括10 × GC buffer 2 μL，200 μmol·L-1 dNTPs 2 μL，0.2 μmol·L-1 PCR引物各1 μL，5×16.67 mkat·L-1 Taq酶0.2 μL，500 ng·μL-1模板1 μL，ddH2O 12.8 μL；扩增程序为94 ℃ 5 m in；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35个循环；72 ℃ 10 min。
反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector(Takara公司，日本)。
转化Escherichia coli DH5α，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行序列测定。
用XhoⅠ和SpeⅠ酶切pMDTM19-T-ROS1和pER8-GFP质粒，酶切回收的ROS1片段和pER8线性片段，用T4 DNA酶连接，挑取单克隆进行PCR检测，所用引物在载体pER8多克隆位点设计(pXhoⅠ-F: 5′-CGCTGAAGCTAGTCGACT-3′；pSpeⅠ-R: 5′-AGGCCTGGATCGACTAGT-3′)。
将阳性克隆扩大培养后，提取质粒进行双酶切验证。
菌液加入20%的甘油保种备用，质粒于-20 ℃保存。
植物诱导表达载体pER8-ROS1的结构如图1所示。
1.3.2 pER8-ROS1载体的诱导表达特性研究烟草处理方法。
用电击法分别将质粒pER8-GFP和pER8-ROS1转入农杆菌LBA4404，得到1#和2#菌株；其中1#菌株用于筛选诱导剂处理的条件，2#菌株在筛选出的诱导条件下进行pER8-ROS1载体的诱导表达特性研究。