MTT法测细胞毒性
细胞毒理学实验技术-MTT
DMSO需要避光加入，加入前将孔内液体吸除干 净，注意不要把结晶吸除
铺细胞一定要均匀，减小实验误差
③ MTT实验应用
大规模抗肿瘤 药物及其适宜 浓度的筛选
体外肿瘤细胞 的临床药物敏 感性实验
检测细胞活 性、细胞增殖 力和细胞毒性
生物活性因子 的活性检测、 肿瘤放射敏感 性测定等
因死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，故成为验材料
MTT溶液 (PBS溶解，5mg/ml。小剂量分装，4℃避光保存，两周内有效。或-20 摄氏度冻存，避免反复冻融)、DMSO
需测定的细胞、中 高 低浓度药物 酶标仪、超净台、显微镜 培养皿、离心管、96孔板、细胞计数板、移液枪等
② 实验方法
接种细胞
培养细胞
呈色
比色
消化细胞，用细胞计数板计数， 调整细胞浓度至104个/ml，接种 至96孔板100μl/孔
A
培养24h后，吸除孔内原培养液， 加入培养液配置的不同浓度药物， 每孔100μl(空白组不做处理)
B
药物反应完成后，配制MTT(培养 液:MTT=5:1)并加入，反应4h
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细胞毒理学实验技术
MTT法检测细胞活性
报告人：
CONTENTS
1 实验原理 2 实验材料与方法 3 实验结果与分析 4 实验应用
① 实验原理
• MTT是一种黄色粉末状化学试剂 • 商品名为：噻唑蓝 • 全称为：3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide
MTT是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥 珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下被还原，生成蓝色的甲瓒(formazan)结晶，结 晶的生成量仅与活细胞数目成正比。还原生成的结晶可在二甲基亚砜(DMSO) 中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。 OD值越大细胞活性越强(或药物毒性越小)。
MTT实验流程
基于MTT的细胞毒性试验细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%As: 实验孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液和药物溶液) ；Ac: 对照孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液，不含药物) ；Ab: 空白孔吸光度(含培养基、MTT溶液，不含细胞、药物) 。
接种细胞：1.用胰蛋白酶消化细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
2.离心细胞悬液（1000rpm 5min），收集沉淀，用培养基重悬，计数。
3.将细胞稀至2.5 x 10^3-5 x 10^3个/ml，这依赖于细胞的生长速度。
4.将细胞移到9ml培养皿中，用排枪在96孔板中间的10列各孔中加入200μl细胞悬液（80孔/板），从第二列开始到第十一列位置，每孔加入0.5 x 10^3-10 x 10^3个cell。
5.将200μl培养基加第1列与第12列的8个孔中。
第1列用读板仪的空白对照，第12列有助于维持第11列的湿度，并将“边缘效应”(edgeeflect)减至最小。
6.将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1~3d，等细胞进入指数生长期时可加人药物（以上可以增加初始细胞浓度，减小培养时间）7.对于非黏附细胞，用新鲜培养基制备细胞悬液将细胞稀释至每毫升5x10^3~100x10^3个/ml，仅取100细胞悬液接种于圆底96孔板，之后立即加入药物。
添加药物8.用培养基将细胞毒性药物5被系列稀释，共制备8个浓度。
选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度时不会杀死细胞为标准。
只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。
一般情况下，每种药物使用3块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。
9.对于贴壁生长的细胞，去除第2~11列各孔中的培养基，这可以通过将皮下注射器针连在吸引管上完成。
10.在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
MTT法和CCK8法检测中药抗病毒活性成分细胞毒性的比较
2、悬浮细胞增殖稳定性比较
MTT法操作简便、成本较低，适用于大批量样本的检测，但反应灵敏度相对较 低。而CCK8法操作步骤稍多、成本较高，但具有更高的反应灵敏度和稳定性。因 此，在选择合适的检测方法时，应根据具体实验需求进行权衡。
谢谢观看
内容摘要
3、氧气：MTT法对氧气的要求较高，需在95%空气和5% CO2的混合气体中培 养细胞，以保证细胞生长的正常进行。而CCK8法则可在常规细胞培养条件下进行， 对氧气的要求较低。
参考内容二
引言
引言
细胞增殖是生物体内的重要过程，对于研究许多生物学和医学问题具有重要 意义。因此，选择合适的细胞增殖检测方法对于科研人员来说至关重要。MTT法 和CCK8法是两种常用的细胞增殖检测方法，本次演示将对这两种方法进行比较， 以便科研人员在研究过程中选择更适合自己的方法。
摘要
city, but CCK8 method is easier to operate and suitable for high-throughput drug screening.
摘要
Keywords: MTT method, CCK8 method, antiviral active ingredients of traditional Chinese medicine, cytotoxicity
材料和方法
1、材料和设备
1、材料和设备
实验所需材料和设备包括：细胞培养液、MTT试剂、DMSO、全自动酶标仪、 96孔细胞培养板、显微镜、细胞刮刀等。
2、实验操作步骤
2、实验操作步骤
（1）细胞培养：将悬浮细胞接种在96孔细胞培养板中，加入适量的细胞培养 液，置于培养箱内培养。 （2）加药处理：根据实验设计，向细胞培养板中加入 不同浓度的药物或对照组，继续培养一定时间。 （3）MTT法检测细胞增殖：在 培养结束后，向每孔加入10 μL MTT试剂，继续孵育4 h。
MTT比色法评价医用一次性输血器的细胞毒性
MTT比色法评价医用一次性输血器的细胞毒性摘要】目的:为研究医用一次性输血器的细胞毒性。
方法:参照中华人民共和国关于输血器具生物学试验的标准，采用能快速评定细胞增殖率和细胞毒性的比色分析方法-MTT比色法，检测医用一次性输血器对小鼠成纤维细胞L929细胞相对增殖率的影响，评价其细胞毒性。
结果:根据细胞毒性反应的评价标准，该次检测的医用一次性输血器呈现高的细胞相对增殖率，其细胞毒性为1级，即无细胞毒性。
结论一次性输血器采用MTT法检测表明，其无细胞毒性，具有良好的安全性。
【关键词】MTT；比色法；一次性输血器；细胞毒性Evaluation on the Cytotoxicity of Disposable blood transfusion device for Medical Useby MTT assayZHOU YixinPU Xiangke【Abstract】Objective To explore the cell toxicity of a kind of medical disposableblood transfusion apparatus. Methods MTT colorimetric analysis, a method which can quickly assess the cell proliferation rate and the cell toxicity, was used to detect the impact on the cell proliferation rate of L929(a mouse fibroblast cell line) caused by the medical disposable transfusion device. The experiment was carried out to evaluate the cell toxicity of the transfusion set according to the biological tests standard of the People's Republic of China(RPC). Results According to cell toxicity evaluation criteria, cells cocultured with the disposable transfusion apparatus still showed high relative growth rate and the cytotoxicity is grade 1 with the reference to the national stands. Conclusion There is no obvious toxicity to cells by using the disposable transfusion device and it will be safe to patients.【Key words】MTT; colorimetric analysis; disposable blood transfusion device;cells toxicity【中图分类号】R385【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)07-0023-02 医用一次性输血器是医疗行业中常用的一类医疗器械，使用量极大，由于一次性输血器直接应用于人体，其材料的安全性直接关系到患者的生命安全。
细胞毒性试验MTT比色法及改进方法
purple color
主要步骤
制备细胞悬液，接种、培养细胞 MTT染色：培养一段时间后，向细胞中加入 MTT溶液，继续在37℃孵育4 h。然后除去培 养液，加二甲基亚砜(DMSO)或盐酸-异丙醇溶 解细胞中的紫色结晶物。 比色：酶联免疫监测仪在490或570nm处测 定溶液的吸光值OD(optical density)。
开始 预实验
细胞接种浓 度
药物浓度
时间控制
污染产生蓝 黑色
离心操作
浓度梯度
5%CO2, 37℃
血清干扰
调零孔与对 照孔
灭菌操作
细胞代数 <30
优质培养板
药品刺激性 大小
悬液均匀度
枪头注细胞 速度
上清液含结 晶物
影响评价结 果
。。。。。。
。。。。。。
翻板
贴壁牢固程 度
MTT改进
XTT
MTS
CCK-8/ WST-8
96孔板
酶标仪
优点
▪灵敏度较传统计数法高 ▪经济
缺点
▪甲臜产物不溶于水，需溶解检测 ▪MTT反应需至少3小时，不适用急性反应
选择适当的细胞接种浓度、药物浓度 设调零孔和对照孔
注事 意项
MTT对菌敏感，应尽量无菌操作 避免血清干扰 现配现用，低温避光，以免分解
需要进一步查阅的操作细节 ---多看文献
优点
缺点
1、使用方便，省去了洗 涤细胞，不需要放射性同 位素和有机溶剂； 2、检测快速； 3、灵敏度高，甚至可以 测定较低细胞密度； 4、重复性优于MTT； 5、对细胞毒性小； 6、为1瓶溶液，毋需预制， 即开即用。
1、价格比较贵。 2、CCK-8试剂的颜色为 淡红色，与含酚红的培养 基颜色接近，不注意的话 容易产生漏加或多加。
细胞毒性试验mtt方法-中英文
用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的细胞（293T细胞、MDCK细胞、Vero 细胞、CEF细胞），用DMEM培养基或MEM培养基（10%胎牛血清，1%双抗）制成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96孔板，每孔加入200ul培养基。
将培养板放到CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养24h，在细胞板孔内分别加入polyMAG/DNA复合物（0.5ul/0.25ug, 0.25ul/0.25ug, 0.25ul/0.5ug），Lipofectamine 2000/DNA复合物（0.5ul+0.2ug），质粒DNA（0.5ug），每个处理设三个复孔。
继续培养24h后，每孔加入20ul的MTT(5mg/ml)，37℃培养4h，终止培养，吸去孔内上清液；每孔加入150ul DMSO，摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶标仪上测定490nm各孔光吸收值，以不加细胞只加培养液的空白对照孔调零（其他实验步骤一致），以未经处理的空白细胞作为对照（三个复孔）。
根据公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=[OD490(样品)/OD490（对照)]x100。
The toxicity of nanoparticles was evaluated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) test. PK15 cells were planked in a 96 well plate with a concentration of 104 cells/well and cultured in 37℃5%CO2for 24 h. Then PK15 cells were treated with nanoparticlesat different concentrations(1:1, 1:2, 1:4), PEI, superfectand lipofectamine especially.PK15 cells untreated were used as control. After incubationfor 6 h,the medium was removed. PK15 cells were cultured in 37℃5%CO2 for 24 h, and were cultured for another 4 h inMTT(0.5%)containing DMEM, then the medium was carefully removed. 150ul/well dimethyl sulfoxide was added and oscillated gentlyto make crystal dissolved. The absorbance at 490 nm was measuredusing a microplate reader. The cell viability was expressed asa percentage of OD490(sample)/OD490(control).。
Mtt说明说和使用方法
产品简介：1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。
由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。
在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。
然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。
细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。
从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。
3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。
4. 本产品为500 次（5个96孔细胞培养板）操作。
产品内容：MTT染色液5ml Formazan溶解液55ml 说明书1份保存条件：MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。
注意事项：1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32 个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。
5. 孵育时，须避光6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书
Hotline ：400-6111-883 E -上HB210525本产品仅作科研用途！MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒Cat NO.40206产品说明书网址： 第1页，共2页MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒产品信息MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒40206ES76 500 T 40206ES80 1000 T 40206ES905000 T产品描述噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl -tetrazolium bromide , MTT ），也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经普遍替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞的活力，细胞增殖以及细胞毒性分析。
检测原理在于：MTT 是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT 还原成为水不溶性的深蓝色MTT -甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。
甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。
甲臜结晶可用DMSO 或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570 nm 的吸光度反映甲臜的生成量。
而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。
本试剂盒以MTT （高纯度）作为指示剂，在经典操作步骤的基础上，采用独特的甲臜溶解液配方，可以直接溶解甲臜沉淀，无需去除原有的培养液。
从而避免因去除培养液时甲臜被部分去除而引起的操作误差。
具有本底低，灵敏度高，线性范围宽，操作简单等特点。
另外，本试剂盒还提供配套的一次性针头过滤器和注射器，为实验带来更多的便利。
产品组分编号 组分 产品编号/规格40206ES76（500T ） 40206ES80（1000T ） 40206ES90（5000T ） 40206-A MTT 粉末 25 mg 50 mg 250 mg 40206-B MTT 溶剂 5 mL 10 mL 50 mL 40206-C 甲臜溶解液 50 mL 100 mL 100 mL×5 40206-D除菌套装1包1包1包运输和保存方法冰袋运输。
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MTT法测细胞毒性
试剂
MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。
含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g
浓HCl（36%）86.2 ul
定容至100ml，过滤除菌
方法
1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔
板，100ul/孔，即细胞数104/孔。
空白孔不加细胞悬液。
,37℃条件下培养24小时。
2.5%CO
2
3.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。
阴性对照孔不
加毒素。
,37℃条件下培养72小时。
4.5%CO
2
5.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml，
37℃条件下培养4小时。
6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30
分钟。
7.酶标仪上测定A570。
8.计算细胞死亡率：
细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100%
注意
1．细胞数范围：（0.5~2）×104。
2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。
3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。
4．设置空白与对照
空白孔：——+——+MTT+有机溶剂
对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂
5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。
用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。