异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)试剂盒说明书
细菌异柠檬酸脱氢酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
细菌异柠檬酸脱氢酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌异柠檬酸脱氢酶（ISOCITRATE DEHYDROGENASE）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酸（NADP）还原后峰值的变化，即采用比色法来测定细菌裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适合于各种细菌细胞裂解悬液样品异柠檬酸脱氢酶的活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase；IDH；EC1.1.1.42）是三羧酸循环（citric acid cycle）或克雷布斯循环（Krehes cycle）中的酶之一，存在于所有生物体内。
细菌异柠檬酸脱氢酶有2种同工酶：同源双体，40至45Kd分子量；单体，80至100Kd分子量。
在细菌体内，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（oxidizedβ-Nicotinamide adenine dinucleotide –phosphate；NADP）依赖性异柠檬酸脱氢酶获得辅酶NADP和辅助因子锰或镁离子（Mn）的推动，脱去底物异柠檬酸的氢和二氧化碳（氧化性脱羧基作用），转化为α-酮戊二酸（α-ketoglutarate），同时生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（reduced β-Nicotinamide adenine dinucleotide –phosphate；NADPH）。
一旦磷酸化或在乙酸环境中，以及有限的葡萄糖条件下，异柠檬酸脱氢酶则失活，从而控制三羧酸循环和乙醛酸旁路（glyoxylate bypass）之间碳的流动。
基于异柠檬酸脱氢酶的NADP依赖性，和作用后所产生的NADPH，通过分光光度仪的峰值变化（340nm 波长），来定量分析异柠檬酸脱氢酶的活性。
异柠檬酸脱氢酶反应系统为：产品内容裂解液（Reagent A）毫升活性液（Reagent B）微升缓冲液（Reagent C）毫升反应液（Reagent D）毫升底物液（Reagent E）毫升阴性液（Reagent F）毫升产品说明书1份保存方式保存活性液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器超声仪：用于裂解细菌细胞（微型）台式离心机：用于样品制备比色皿或96孔板：用于比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的活性液（Reagent B）置入冰槽里融化。
乙醛酸循环的产物
乙醛酸循环的产物
题目：乙醛酸循环的产物是( )。
A.琥珀酸
B.乙醛酸
C.苹果酸
D.乙酰CoA
答案：C.苹果酸
乙醛酸循环是植物和某些微生物（大肠杆菌、醋酸杆菌等）及一些无脊椎动物细胞内脂肪酸氧化分解为乙酰CoA之后，在乙醛酸循环体(glyoxysome)内生成琥珀酸、乙醛酸和苹果酸；此琥珀酸可用于糖的合成的过程。
大多数动物和人类细胞中没有乙醛酸循环体，无法将乙酰CoA转变为糖。
油料植物种子(花生、油菜、棉籽等)萌发时存在着能够将脂肪转化为糖的乙醛酸循环。
水稻盾片中也分离出了乙醛酸循环中的两个关键酶——异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶。
脂肪酸经过β-氧化分解为乙酰CoA，在柠檬酸合成酶的作用下乙酰CoA与草酰乙酸缩合为柠檬酸，再经乌头酸酶催化形成异柠檬酸。
随后，异柠檬酸裂解酶(isocitratelyase)将异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸。
再在苹果酸合酶(malate synthetase)催化下，乙醛酸与乙酰CoA结合生成苹果酸。
苹果酸脱氢重新形成草酰乙酸，可以再与乙酰CoA缩合为柠檬
酸，于是构成一个循环。
其总结果是由2分子乙酰CoA生成1分子琥珀酸，反应方程式如下：2乙酰CoA+NAD+→琥珀酸+2CoA+NADH+H+ 琥珀酸由乙醛酸循环体转移到线粒体，在其中通过三羧酸循环的部分反应转变为延胡索酸、苹果酸，再生成草酰乙酸。
然后，草酰乙酸继续进入TCA循环或者转移到细胞质，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP carboxykinase)催化下脱羧生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，PEP 再通过糖酵解的逆转而转变为葡萄糖6磷酸并形成蔗糖。
索莱宝（Solarbio）线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒说明书
线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm ）活性检测试剂盒说明书微量法货号: BC2165规格: 100T/48S 产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液一液体60 mL×1瓶4℃保存提取液二液体600 μL×2支-20℃保存提取液三液体40 mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶常温保存试剂三液体10 mL×1瓶4℃保存试剂四粉剂×2支-20℃保存试剂五液体5 mL×1瓶常温保存试剂六液体15 mL×1瓶常温保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1、提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；2、试剂一：临用前加入5 mL 试剂三，充分溶解待用；3、试剂二：临用前加入5 mL 试剂三，充分溶解待用；4、试剂四：临用前加入0.375 mL 双蒸水，充分溶解待用；5、标准品：10 mg α-酮戊二酸。
临用前加入684 μL 蒸馏水，配成100 μmol/m L 标准液；6、工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按1:1比例混合，现配现用。
产品说明：线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase ，ICDHm ），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。
异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD 为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP 为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD 还原成NADH ，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展
结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展王静娴;杨春【摘要】结核分枝杆菌是一种胞内感染菌,巨噬细胞是其寄生场所.结核分枝杆菌通过阻止吞噬溶酶体的融合、减少巨噬细胞凋亡、降低巨噬细胞对刺激应答的敏感性等途径逃避巨噬细胞的免疫监视和攻击,并在细胞内存活、增殖;而巨噬细胞又是抗菌免疫的主要效应细胞,通过直接杀伤和分泌多种细胞因子,对结核分枝杆菌具有免疫调节、呈递抗原等作用.深入研究结核分枝杆菌对巨噬细胞的免疫逃逸机制及巨噬细胞抗结核免疫作用,对研究宿主抗结核免疫机制及设计新型结核病疫苗有重要意义.【期刊名称】《微生物与感染》【年(卷),期】2010(005)003【总页数】5页(P181-185)【关键词】巨噬细胞;结核分枝杆菌;免疫逃逸;免疫作用【作者】王静娴;杨春【作者单位】重庆医科大学病原生物学教研室/神经科学研究中心,重庆400016;重庆医科大学病原生物学教研室/神经科学研究中心,重庆400016【正文语种】中文结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。
近年来，结核病疫情严重，位居单一病原引起患者死亡的严重传染病之首。
目前全球结核感染者约占总人口的1/3，每年有930多万人发展为活动性结核病，并有180多万人死于该病[1]。
大多数情况下，只有少数结核分枝杆菌感染者发展为活动性肺结核病；绝大多数感染者属无症状和无传染性的，即潜伏性结核感染。
巨噬细胞是机体防御系统的第1道屏障，一方面发挥着抵抗结核分枝杆菌的作用，另一方面又是结核分枝杆菌体内滞留、造成潜伏感染的主要场所。
巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用对结核病的发生、发展、预后起着非常重要的作用，因此探讨两者的相互作用机制对结核病的防治尤为重要。
本文就近年来该领域的研究进展作一综述。
1 结核分枝杆菌对巨噬细胞的免疫逃逸机制感染结核分枝杆菌后，只有少数感染者发展为活动性肺结核病，大多数为潜伏性结核感染。
异柠檬酸裂解酶
结核病严重影响人类健康。
潜伏期感染是其化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后再次复发的主要原因，也是结核病控制形势严峻的主要因素之一。
异柠檬酸裂合酶（Isocitrate lyase, ICL）在结核菌的潜伏期致病中起至关重要作用，是一个潜在的药物靶标。
它作为乙醛酸循环的第一个关键酶，催化异柠檬酸裂解生成琥珀酸和乙醛酸，从而改变碳源的流向，有利于碳源的积累，为结核菌在以脂肪酸或乙酸为碳源的环境下生长提供了有利条件。
因此筛选新型的ICL抑制剂，有利于抗结核药物的开发。
本文通过PCR方法获得ICL的编码序列，克隆至原核表达载体pQE30；将重组质粒pICL-pQE30转化大肠杆菌JM109，优化可溶性重组蛋白的表达，Ni sepharose纯化可溶性重组蛋白。
研究酶反应的线性范围以及反应时间，考察DMSO对ICL活力的影响，对测活条件进行优化，确定反应体系，并对高通量筛选模型进行评价。
异柠檬酸裂合酶（Isocitrate lyase，缩写ICL，EC4.1.3.1）是以一种在乙醛酸循环中将异柠檬酸切割为乙醛酸和琥珀酸的酶。
其产物再通过苹果酸合酶合成苹果酸，跳过了三羧酸循环（TCA循环）中脱去CO2的两步。
这一途径广泛存在于细菌、真菌与植物中。
B12是几种变位酶的辅酶，如催化Glu转变为甲基Asp的甲基天冬氨酸变位酶、催化甲基丙二酰CoA转变为琥珀酰CoA的的甲基丙二酰CoA变位酶。
B12辅酶也参与甲基及其他一碳单位的转移反应。
生理功能主要有两个：①作为甲基转移酶的辅因子，参与蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成，如使甲基四氢叶酸转变为四氢叶酸而将甲基转移给甲基受体（如同型半胱氨酸），使甲基受体成为甲基衍生物（如甲硫氨酸即甲基同型半胱氨酸），反应如图所示。
因此维生素B12可促进蛋白质的生物合成，缺乏时影响婴幼儿的生长发育。
②保护叶酸在细胞内的转移和贮存。
维生素B12缺乏时，人类红细胞叶酸含量低，肝脏贮存的叶酸降低，这可能与维生素B12缺乏，造成甲基从同型半胱氨酸向甲硫氨酸转移困难有关，甲基在细胞内聚集，损害了四氢叶酸在细胞内的贮存，因为四氢叶酸同甲基结合成甲基四氢叶酸的倾向强，后者合成多聚谷氨酸。
纤维素酶酶活性测定试剂盒说明书
纤维素酶（cellulase ，CL ）/羧甲基纤维素酶活性测定试剂盒说明书微量法100管/48样注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义：CL （EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化羧甲基纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。
测定原理：采用蒽酮比色法测定CL 催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。
试剂的组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入5mL 蒸馏水和45mL 浓硫酸充分溶解待用。
样品测定的准备：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g ）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
加样表和测定步骤：37℃振荡反应1h 后，90℃水浴15min （盖紧，防止水分散失），冷却后试剂名称 对照管 测定管 样本 50 50 试剂一（μL ） 90 试剂二（μL ） 370 370 蒸馏水（μL ）180908000g 25℃离心10min，取上清，得糖化液糖化液(μL)140 140试剂三(μL)260 260 混匀，90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，测620nm下吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。
第六章 微生物的新陈代谢 第二节 分解代谢与合成代谢的联系-文档资料
的间隔程度低，故反应的控制主要在简单的酶分子
水平上进行。
二、代谢物回补顺序
代谢物回补顺序（anaplerotic sequence），又称代谢 物补偿途径或添补途径（replenishment pathway），
是指能补充两用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢
物的那些反应。
作用：当重要产能途径中的关键中间代谢物必须被
在乙醛酸循环中有两个关键酶——它们可使丙酮酸和乙酸等化合物 合成4C二羧酸，以保证微生物正常生物合成的需要。
乙醛酸循环的总反应式：2丙酮酸→琥珀酸＋2CO2
乙醛酸循环中的两个关键反应：
具有乙醛酸循环的微生物，普遍是好氧菌， 例如可用乙酸作唯一碳源生长的一些细菌，包括 Acetobacter（醋杆菌属）、 Azotobacter（固氮菌属）、 E.coli、
径，可使TCA循环不仅具有高效产能功能，而且还兼有 可为许多重要生物合成反应提供有关中间代谢物的功 能，Eg.草酰乙酸可合成天冬氨酸， α －酮戊二酸可 合成谷氨酸，琥珀酸可合成叶卟啉等。
苹果酸合酶 （malate synthase，MS）
异柠檬酸裂合酶 （isocitrate lyase，ICL）
微生物学
浙江工业大学生物技术系
裘娟萍 钟卫鸿 邱乐泉 汪琨
第二节 分解代谢和合成 代谢的联系
分解代谢与合成代谢在生物
体内是偶联进行的，它们之间的
关系是对立统一的。
分解代谢与合成代谢的关系图
联接分解代谢与合成代谢的中间代谢物有12种。
一、两用代谢途径
凡在分解代谢和合成代谢中均具有功能的代谢途径， 称为两用代谢途径（amphibolic pathway）。
大量用作生物合成的原料而抽走时，仍可保证能量代 谢的正常进行。
微生物的新陈代谢 第二节 分解代谢和合成代谢的联系
广东海洋大学 农学院生物技术系
具有乙醛酸循环的微生物，普遍是好氧 菌，乙酸作唯一碳源生长的一些 细菌， 包括：Acetobacter（醋杆菌属）、 Azotobacter（固氮菌属）、E.coli、 Enterobacteraerogenes（产气肠杆菌）、 Paracoccusdenitrificans（脱氮副球菌） 真菌有酵母属、青霉菌和黑曲霉。
N2+2e-+6H++(18~24)ATP 2NH3 +H2+(18 ~24)ADP+ (18 ~24) Pi
➢ NH3去路：自生固氮菌不能储存，也不分泌，很快同化； 共生固氮菌分泌至根瘤细胞中为植物所利用。 固氮阶段
N2 2NH3 + H2 75% 还原力用来还原N2，25%的还原力 以H2形式浪费
微生物通过固氮酶将大气中的氮气催化还原 为氨的过程。
（一）固氮微生物(nitrogen-fixing organism, diazotrophs)
根据生态类型分
自生固氮菌(free-living nitrogen-fixer) 共生固氮菌(symbiotic nitrogen-fixer) 联合固氮菌(associative nitrogen-fixer)
二、代谢物回补顺序
代谢物回补顺序（Anaplerotic sequence）
补救途径 （salvage pathway ） 添补反应 （anaplerotic reaction） 代谢物补偿途径（replenishment pathway） 能补充两用代谢途径中因合成而消耗的中 间产物的那些反应。
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货号: QS3114 规格：50管/48样异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）试剂盒说明书
紫外分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。
ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。
测定原理：
ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
自备实验用品及仪器：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂四：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：液体×2支，4℃保存；临用前每支加入560μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍4℃保存；
试剂六：粉剂×3瓶，4℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用。
用不完的试剂-20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
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340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min以上，测定时加入1220µL混合液和300µL 试剂六测定。
ICL活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2443×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min /104cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=4.886×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.52×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
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