荧光光谱
荧光 光谱
2）荧光偏振
（1）荧光偏振现象及用途 一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏 振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的，可 以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发 射过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的 结合以及蛋白质的内部动力学。
3）.荧光能量共振转移
4). 时间分辨光谱： 输入脉冲，然后进行对接收的信号进行相应分析。 时间分辨寿命；时间分辨各向异性。
荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方 法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然 容易解释，但需要做很多假设。 瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。 可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。 各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性 相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。 各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。 目前还是采用时间分辨进行测量。
2-3个数量级，比原子吸收分光光度法高103 ～104
倍，检测限可
分析成本低
设备简单，操作简单快速，计算机进行仪器控制和数据处理 提供激发光谱、发射光谱等许多信息
2).荧光光谱的特征 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波
长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 ( 如
荧光寿命
当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸 收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁 的形式发出荧光回到基态.当激发停止后,分子的荧光 强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光 寿命.
5). 荧光标记
荧光光谱分析
百泰派克生物科技
荧光光谱分析
荧光光谱法（又称荧光分析法或分光荧光测定）是一种电磁光谱法，可以测量样品吸收光子后发出的光子强度。
实际上，大多数荧光分子是芳香族的，如蛋白质/肽中的色氨酸。
光学技术，如UV-Vis、圆二色谱（CD）、傅立叶变换红外（FTIR）和荧光光谱，都被用于获取被测化合物的结构、相互作用和动力学信息。
荧光光谱是研究溶液状态和显微镜下蛋白质/肽的实时结构和动力学的重要研究工具。
荧光光谱分析。
生物制药，特别是蛋白质和多肽类药物，在整个研发过程中都面临着独特的挑战。
在成功批准和上市之前，需要对治疗性蛋白质/肽的生物物理、生化特性和3D结构有透彻的了解，因为产品的活性、稳定性、毒性、功效和保质期会因结构-活性关系而受到影响。
与小分子不同，这些大分子需要多种分析方法结合进行分析。
荧光光谱法可应用于：1，通过改变荧光强度来探测结构变化或两个分子的结合；2，通过色氨酸荧光的波长定位色氨酸残基（在蛋白质表面或深埋在蛋白质内部）；3，通过荧光偏振和各向异性研究荧光团迁移率。
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱
延迟荧光与普通荧光的区别主要在于 辐射寿命不同 。这种长寿命 的延迟荧光来源于从第一激发三重态（T1）重新生成的S1态的辐射跃 迁。即延迟荧光产生的过程为：
S1→T1→S1→S0+hνf
28
延迟荧光 E型延迟荧光：
当第一激发单重态S1与第一激发三重态T1能差较小时，T1态有时可从 环境获取一定的热能后又达到能量更高的S1态。即
跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不
重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。
9
失活的途径
电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过
辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。
失活途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换
外转换
振动弛豫
= s[Iεscs/(Isεc)]
s、 εs、cs和Is分别是参照物的荧光量子产率（已知）、摩尔消光系数、溶 液浓度和荧光强度； 、 ε 、c和I分别是被测物的荧光量子产率（未知）、摩 尔消光系数、溶液浓度和荧光强度。 参照物应是已知、无自吸收、无浓度猝灭、在被测物所用溶剂中可溶、易
纯化、稳定和对杂质不敏感的物质。常用的参照物如罗丹明B和喹啉硫酸氢盐
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大。
10
无辐射跃迁失活的途径 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振 动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时 间一般为10-12 s。 内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射 能级跃迁。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。
6
分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级 )：吸收 特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 失活： 激发态 →基态：多种途径和方式 (见能级图)；速 度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱
OH H2C O HO O H2C OH HO OH O HO C H2 O OH OH OH O HO O HO CH2 O HO O CH2 HO OH O O OH HO O HO O HO H2C OH
OH
O
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2
HO
OCH2CH2(OCH2CH2)n OH
β－CD∶OP 加合物的组成
用摩尔比法测定了βCD∶OP 二元体系的组 成. 由图4 可以看出, β - CD 与OP 的摩尔比为1∶1 , 说明在溶液中形成了 1∶1 的二元加合物,
加合物形成的机理及其结构
OP 疏水性烷基链的长 度、径度和体积分别为 1.036 nm、0.400 nm和 0.216 nm3 。 β- CD 空腔的深度 (0.780 nm) 、空腔口直 径(0.780 nm) 和体积 (0.346nm3 ) 相比, OP 的 疏水性烷基链中至多有 6 个碳被包络在空腔内, 其余未被包络部分和极 性头基位于空腔外
H2C
H2C
CH3 N
NpMA
PyMA
DMAA AMPS NpMA PyMA
AIBN DMF
乙醚
乙醇多次洗涤干燥
萘和芘标记聚电解质在水溶液中的紫外光谱和荧光光谱
在水溶液中的紫外吸收 光谱与小分子萘和芘的 光谱基本相同, 说明萘 和芘标记到聚电解质上 并没有对它们的光谱结 构产生明显影响, 而且 混合溶液表现出两者光 谱的迭加. 290 nm 处萘有一吸收带, 而芘的吸收很弱, 所以 在混合溶液中可用290 nm 激发萘; 343 nm 处仅 有芘的吸收, 因此可用 343 nm 选择性地激发芘.
330 nm 为中心的发射带 是萘的荧光, 360～ 440 nm 是单体态芘的发射光 谱, 480 nm 是芘激基缔 合物的发射光谱.
荧光光谱名词解释
荧光光谱名词解释
以下是几个与荧光光谱相关的常见名词的解释：
1. 荧光：荧光是指物质吸收光能后，在经历激发态到基态跃迁过程中发出的光辐射。
这种光辐射通常具有较长的波长，可见光范围内的颜色。
2. 激发：激发是指将物质从基态转移到激发态，使其能级上升，通常是通过吸收光能或其他能量来实现。
激发是产生荧光的前提条件。
3. 激发光源：激发光源是用于激发荧光的光源。
常见的激发光源包括紫外线灯、激光器和白炽灯等。
激发光源的选择通常取决于所研究的物质的特性和所需的激发波长。
4. 荧光发射：荧光发射是指物质在激发后返回基态时所发出的光辐射。
荧光发射的波长范围通常比激发光波长长，且具有特定的荧光峰。
5. 荧光光谱：荧光光谱是通过测量荧光发射强度随波长的变化而得到的图谱。
荧光光谱可以提供有关物质荧光性质的信
息，如发射波长、发射强度和荧光峰的位置等。
6. 荧光光谱峰：荧光光谱峰指荧光发射谱中最强的发射峰。
荧光光谱峰的位置和强度可以提供关于物质结构和荧光特性的重要信息。
7. 荧光量子产率：荧光量子产率是指物质发生荧光的效率，即荧光发射光子数与吸收光子数之比。
荧光量子产率越高，表示物质更有效地发出荧光。
以上是一些与荧光光谱相关的名词解释。
荧光光谱是研究物质荧光性质和特征的重要工具，广泛应用于生物化学、材料科学、分析化学等领域。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱（ex）和发射光谱（em）1、荧光和磷光均为发光光谱，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱来确定。
绘制激发光谱时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱（excitation, ex）。
激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。
当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。
2、如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光发射光谱（emission, em）。
在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
3、荧光（磷光）发射光谱特征：（1）Stokes 位移：在溶液中，分子荧光波长总是大于激发光的波长，这种波长移动的现象称为Stokes 位移。
这是由于激发分子通过振动弛豫和内转换损失了部分激发能，也由于溶液中溶剂分子与激发分子的碰撞，也会有能量的损失。
因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关：因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到不同的电子激发态，而具有几个吸收带。
由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级（荧光光谱的定义：从第一振动激发单重态跃迁到基态各个振动能级），所以荧光发射光谱与激发波长无关。
（3）镜像规则：通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，其形状与基态振动能级分布有关。
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出浓度；
比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移 （什么是stokes位移？） 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激
发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l
AES－热致发光，激发态原子数遵守波尔兹曼分布、发射光
谱比较复杂。
荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光激发后能发射出比激发光 波长波长的辐射，即荧光。光致发光 激发光－待测物质分子成为激发态时所吸收的光 发射光－处于激发态的分子回到基态时所产生的光。 荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激 发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行 定性或定量。
荧光&磷光法
Fluorescence & phosphorescence
荧光与发射光谱的关系
荧光光谱法（FS）－原子吸收光能激发在返回基态时，所发 射的荧光强度进行定量和定性的发射光谱法。
FS & AES
共性：均为发射光谱
FS-光致发光，吸收具有选择性、激发态原子数不遵守波尔
兹曼分布、发射光谱比较简单。
I0 F KQ ln KQI 0 bc kc I0 I A
F, fluorescence intensity; K, constant, I0, excitation intensity; , molar absorbance constant; b, optical path; c, concentration.
发态的二振动能级
之间的跃迁几率最 大，相反迁也然
蒽的激发光谱和荧光光谱
蒽的激发光谱和荧光光谱
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500 nm
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光分析必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常 数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强 的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环上 有供电基，使荧光增强。
吸收滤光片- 可见光谱区使用 干涉滤光片- 全光谱区使用
截止滤光片(cutoff filter) 带通滤光片(bandpass filter) 全息滤光片（notch filter）
分光系统
分光系统
其他部件
样品池 单色器
检测器
其他类型荧光检测器
激光诱导荧光检测 发光二极管诱导荧光检测
动
四、影响荧光强度的外部因素
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加
温度升高，非辐射的几 率增强，荧光几率减少
四、影响荧光强度的外部因素
3.溶液pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制
大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的
酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的
S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l
‘ > 2
l 2> l 1；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
四、影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将
使化合物的荧光发生变化；
① 溶剂不纯 ② 溶剂的选择（极性）－测定荧光光谱时一定要注明所用溶剂。 许多共轭芳族化合物，激发时发生了π→π*跃迁，其荧光光谱受溶 剂极性的影响较大。荧光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移
内转换 S2 S1 能 量 吸 收
内转换 振动弛豫 系间跨越
T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
荧光&磷光法的基本原理
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
1GB=1024MB 1TB=1024GB
1961年，中国大陆第一台激光器在中科院长春光机所研制成功； 1964年 首次出现“激光”这一词语
中国研制成功的新一代激光武器是国际上最先进的激光武器之一，可有效对付超
高速战略侦察机；能使F－117隐形飞机的激光制导、红外导弹完全失灵。
种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸 中的要强些。
四、影响荧光强度的外部因素
4.溶液pH的影响
悬浮物－光散射
溶解氧－荧光淬灭
pH值
5.玻璃器皿的影响
高度洁净
荧光淬灭
浓度过大导致“自熄灭”（即荧光淬灭）效应 即样品浓度超过一值后，荧光强度不再增加反而减小
Positive-Signal Indirect Fluorometric Detection in Ion Chromatography. Anal. Chem. 1987, 59, 1362-1364.
2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能
级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l ‘2 )。 c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）
成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布与第 一激发态上的各振动能级分布类似
基态上的零 振动能级与第一激
时间分辨荧光检测
其他类型荧光检测器
激光诱导荧光检测 发光二极管诱导荧光检测
时间分辨荧光检测
光化学衍生荧光检测
激光诱导荧光检测
Laser-induced fluorescence detection 激光
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation，LASER）
Moderate sensitivity; offers structural information High sensitivity
Relative low sensitivity
Restriction in buffer choice
CL
--
10-8 10-12
Not universal
激光的特点
溶剂 溶液 玻璃容器 温度
荧光衍生
荧光法的缺陷： 可产生荧光的物质非常有限，就是只有少数化合 物能发射荧光。
解决的途径：
化学衍生－通过加入某试剂与待测药物发生化学反应或物
理缔合，生产物能够产生荧光。 A+B C hv A+B A-B hv
光子衍生
Basic principle of fluorescence
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至 低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激
发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为
磷光检测
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （ 1 ）通常借助于荧光和磷光
寿命的差别，采用磷光镜的装
置将荧光隔开。 （ 2 ）采用脉冲光源和可控检 测及时间分辨技术。
激发光源
UV-VIS
氙灯、高压汞灯（365 nm）
分光系统
滤光片（filter）
浓度很低时，将括号项近似处理后：
If = 2.3 I0 l c = Kc
设IF为荧光强度； I0入射紫外线强度； It为透过溶液后紫外线强度； Ia为溶液吸收紫外线； C为溶液中被测物质的浓度； l为溶液层的厚度。
荧光的定量方法
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，
Q，荧光物质的量子效率；I0，激发光强度；IA，样品吸收的光能；，荧光物质 的摩尔吸收系数；b，光程，c，浓度，K常数
荧光分析法的特点